Al fine di confermare la localizzazione cellulare della proteina, sono state utilizzate linee trasfettate con FDPAU1 e AU1 (controllo negativo).
Fig 13 e 14. Immunofluorescenza di Giardia.
La FDP mostra localizzazione citosolica ed ha una distribuzione uniformente. Non sembra ci siano differenze tra le diverse linee cellulari che mostrano tutte un segnale molto forte.
La distribuzione è la medesima anche nei trofozoiti incistanti. A 21 e 42 ore dall’incistamento è talvolta osservabile una piccola popolazione cellulare (talvolta in cui FDP sembra associato alla membrana delle ESV. Queste vescicole si formano solo durante l’incistamento ed al loro interno si trovano proteine (tra cui CW1 e CW2, proteine della parete della cisti). Non sono state trovate cisti in cui FDP fosse espressa.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di
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DISCUSSIONE
Le flavoproteine a doppio ferro (FDP) sono espresse in procarioti anaerobi, stretti o facoltativi e in alcuni protozoi parassiti microaerofili. Questa proteina sembra essere sintetizzata in risposta a stress ossidativi e nitrosativi. Le FDP sono state recentemente identificate in un ristretto gruppo di protozoi, tra questi, Giardia intestinalis, l’agente eziologico della giardiasi, una malattia infettiva umana.
L’FDP di G. intestinalis, a partire da un gene sintetico è stata espressa, purificata, e caratterizzata utilizzando tecniche come: raggi X, cristallografia e spettroscopia.
Esperimenti preliminari da me effettuati avevano il fine di verificare se la proteina ricombinante, espressa in E. coli, stimolasse il sistema immunitario dell’ospite e se gli anticorpi così ottenuti, potessero riconoscere la proteina anche in vivo, dimostrandone l’espressione nei trofozoiti.
Si puo’ osservare dalla foto 6, la presenza di un unica banda per line al peso molecolare atteso. La proteina ricombinate stimola il sistema immunitario del topo e sembra comportarsi come la proteina nativa di G. intestinalis.
Il siero iperimmune di topo, ottenuto dopo stimolazione con FDP ricombinate, è in grado di riconoscere la proteina nativa espressa dal protozoo.
Da esperimenti di immunofluorescenza si puo’ osservare che la FDP in giardia ha una distribuzione citosolica uniforme.
Indagini preliminari sulla proteina, hanno mostrato che FDP ha attivita’ ossidatati a nitrosativa. Per investigare in tal senso i trofozoiti sono
stati esposti a diverse concentrazioni differenti di NO, e in presenza o assenza di ossigeno.
Differenti concentrazioni di NO non alterano l’espressione della proteina.
Se viene rimosso l’ossigeno dal medium si puo’ osservare la scomparsa della banda a 45KDa. Lo stress ossidativo, ma non quello nitrosativo, elimina totalmente la reattività anticorpale. Questi risultati sembrano indicare un ruolo nel controllo dello stato di ossidazione cellulare.
L’esposizione delle cellule a H2O2 causa la scomparsa della proteina,
nel caso vengano usate concentrazioni maggiori di 100 uM. La scomparsa della proteina potrebbe essere causata o da una rapida proteolisi oppure da una secrezione nel surnatante. Fin ora non è stato possibile trovarla nel surnatante, suggerendo che non È coinvolto un fenomeno legato alla secrezione specifica di FDP. Tuttavia l’utilizzo di un inibitore di proteasi, quale MG132, sembra impedire la scomparsa della proteina. Non è ancora chiaro il meccanismo di protezione sia diretto (protezione dalla proteolisi) o indiretto (blocco del meccanismo di secrezione della proteina). Ulteriori studi sono in corso per chiarire il fenomeno.
Non è ancora noto il motivo per il quale G. lamblia colonizzi preferenzialmente duodeno o digiuno, piuttosto che il colon (meno aerobica), dove è presente la maggior parte della microflora batterica. I trofozoiti di Giardia sono molto vulnerabili a H2O2, soprattutto perché
mancano sia catalasi e H2O2-reduttasi. Pertanto, si è tentati di sostenere
che la localizzazione peculiare di Giardia nel tratto prossimale dell’intestino tenue sia legata al potere tampone redox più elevato di questo tratto intestinale rispetto a quello intestino crasso (Fig. 6); L’ipotesi sul perchè questo parassita colonizzi preferenzialmente la parte prossimale dell’intestino è perché qui vi è una maggiore capacità di tampone redox e quindi una minore propensione allo stress ossidativo rispetto al colon.
Dati di immunoflurescenza mostrano che la localizzazione della proteina è citosolica. E’ possibile osservarla sia nei trofozoiti in fase
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di
41 vegetativa ma anche in trofozoiti incitanti. A 12 ore dall’incistamento è stata talvolta osservabile un’aggregazione di FDP nel citosol invece di una distribuzione uniforme. Tuttavia questo potrebbe non essere significativo. FDP non è presente nelle cisti tuttavia qualche volta è stata osservabile un aggregazione della proteina alle pareti della cisti. A tempo 21 e 42 ore, sembra che FDP non si trovi nelle ESV anche se sembrerebbe esservi associata. Il forte segnale nel citosol non sembra pero’ chiarire definitivamente l’esistenza di questa associazione.
L’utilizzo di anticorpi da noi prodotti suggerisce che la proteina era piu’ abbondante in linee cellulari Mz-resistenti piuttosto che nelle linee parentali sensibili al farmaco. Questo potrebbe suggerire una correlazione tra livello di espressione della proteina e resistenza ad Mz. Per investigare in questa direzione, ciascuna linea, sensibile e resistente ad Mz, era stata trasformata con FDP-AU1 e selezionata con puromicina. Tutte le linee sono stabili e vitali. Sono eseguiti western blotting ma non è stato possibile apprezzare differenze utilizzando anticorpi anti-AU1. E’ possibile che il forte segnale mascheri differenze tra le linee cellulari.
Il SAGE ha mostrato che i trascritti di FDP sono up-regolati durante l’incistamento con la piu’ alta espressione a 21 ore. I risultati del western, usando linee iperesprimenti FDP e utilizzando anticorpi anti-AU1, hanno mostrato che FDP è down-regolata durante l’incistamento. La piu’ alta espressione è nei trofozoiti della fase vegetativa. Tali risultati sono confermati anche da esperimenti di immunofluorescenza.
E’ necessario condurre ulteriori esperimenti per determinare se la iperespressione della proteina porti dei vantaggi alla cellula, quali una maggiore resistenza al farmaco. Verificare se il knock-down di FDP possa essere vitale ed avere effetti sulla resistenza al farmaco ed infine, effettuare studi in vivo, in condizioni fisiologiche, per verificare o meno una maggiore efficacia nella colonizzazione dell’intestino da parte delle diverse popolazioni cellulari iperesprimenti.
Sequenza vettore AU1
TACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCAGCTGATCGGCGCCGGGATGGGGGT CCTGGGGCAGATAGCCGTTGGAACGGACAGCGACTTCCGCATCGTCAAGCACGCCCGTCGAACCCGGAAAAGGTAA ATATTCACTTCAGCCCTCACTCGAGGGCACCGGGCTTGCGGGTCATGCACCAGGTGCGCGGTCCTTCGGGCACCTC GACGTCGGCGGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAAAAGGGGAGGTTGCGGGGCGCGGAGGTCTCCAGGAAGGC AGGCACCCCGGCGCGCTCGGCCGCCTCCACTCCGGGGAGCACGACGGCGCTGCCCAGACCCTTGCCCTGGTGGTC GGGCGAGACGCCGACGGTGGCCAGGAACCACGCGGGCTCCTTGGGCCGGTGCGGCGCCAGGAGGCCTTCCATCTG TTGCTGCGCGGCCAGCCGGGAACCGCTCAACTCGGCCTGCGCGGGCCGATCTCGGCGAACACCGCCCCCGCTTCG ACGCTCTCCGGCGTGGTCCAGACCGCCACCGCGGCGCCGTCGTCCGCGACCCACACCTTGCCGATGTCGAGCCCG ACGCGCGTGAGGAAGAGTTCTTGCAGCTCGGTGACCCGCTCGATGTGGCGGTCCGGGTCGACGGTGTGGCGCGTG GCGGGGTAGTCGGCGAACGCGGCGGCGAGGTGCGTACGGCCCGGGGGACGTCGTCGCGGGTGGCGAGGCGCAC CGTGGGCTTGTACTCGGTGCCCATGGATTTTAAAATCTGGGGCGCCTGTAATTAAAGGCGTTATTTGTGGTCAAGCTT GATATCGAATTCGGGCCCGACACGTACCGCTACATCTAGACTCCTCAACAGAGAGTCAGAGTAAACGAATTTCTGCC GGTCAGGTCGTCTTGGGGACGGGGGAGATGTTTGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCC AATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTA CCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCCTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCT TCCCAACAGTTGCGTAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGG TTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCA CGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCG ACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGT TGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGAT TTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAA AATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATAC ATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATT CAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGA AAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTG AGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTAT TGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGA AAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAAGCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTTCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCT TGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAA CAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGGGCGGA TAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGC GTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGC AGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCA GACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTG ATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATC TTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTG CCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTA GTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCA GTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCG GTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAG CGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAATesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di 43 CAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGA CTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACG GTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACC GCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAA GAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGA CTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTAT GCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGAT
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