Doverosa premessa alla trattazione di questo paragrafo è la sottolineatura di come i pochi risultati disponibili relativi agli effetti di residui farmaceutici su organismi animali e vegetali siano stati ottenuti sovente prescindendo da alcune importanti considerazioni.
Come evidenziato già dalla prefazione, si tratta di una categoria di composti con le seguenti caratteristiche comuni:
- concepimento e sintesi delle molecole finalizzate al maggiore e quanto più rapido assorbimento della specie chimica nell’organismo e all’effetto a basse concentrazioni;
- semi-persistenza di tali sostanze, in quanto il tasso di immissione supera la velocità di degradazione in ambiente;
- degradazione sia all’interno dell’organismo che nelle matrici ambientali e conseguente formazione di metaboliti e sottospecie chimiche con caratteristiche diverse e sovente più deleterie;
- formazione di complesse misture con altre molecole ed effetti sinergici poco controllabili; - azione su bersagli specifici, poco rappresentati dai consueti test di tossicità generica; - possibilità di bioconcentrarsi e biomagnificare.
Da queste considerazioni emerge come i test di tossicità inerenti queste sostanze finora condotti si rivelino inadeguati nel rappresentare il reale effetto dei medicinali sui vari organismi.
Troppo spesso si tratta di test di tossicità acuta, nei quali gli organismi sono esposti a varie concentrazioni della sostanza indagata, registrando endpoint letali, come l’immobilizzazione o la morte dell’individuo.
I farmaci non possono però essere considerati alla stregua di contaminanti tradizionali perchè, come detto, agiscono con meccanismi complessi su bersagli sensibili, in funzione della diversa categoria ATC (anatomica - terapeutica - chimica) di appartenenza.
pesci) sono sprovvisti dei bersagli specifici sui quali può esplicarsi l’effetto del farmaco, effetto che nelle specie viventi sensibili ad esso possono verificarsi a concentrazioni ben inferiori a quelle di letalità.
Inoltre anche a livello ecologico si verifica la contemporanea presenza di varie specie nello stesso luogo fisico ed i legami e le dinamiche a livello di comunità possono influire notevolmente sul risultato complessivo dell’azione di una o più molecole.
Il semplice confronto tra concentrazione rilevata in ambiente e concentrazione di letalità derivante da un test acuto con endpoint letali non può quindi essere ritenuto soddisfacente e sufficiente a comprendere dinamiche così complesse.
L’unico approccio foriero di risultati attendibili nel campo del biomonitoraggio si rivela essere l’integrazione delle linee di evidenza e di ricerca rappresentata dal TRIAD.
In esso studi chimici (concentrazioni totali e biodisponibili di contaminanti di interesse), eco - tossicologici (test di tossicità ed uso di biomarker) ed ecologici (studi a livello di popolazione e comunità) vengono integrati al fine di avere una comprensione complessiva e globale del fenomeno, affrontato nella sua interezza.
Ciascuna delle tre linee di evidenza prevede test e analisi specifiche articolati su quattro livelli di complessità crescente:
1) SCREENING SEMPLICE; 2) SCREENING RIFINITO; 3) ANALISI DI DETTAGLIO; 4) ANALISI CONCLUSIVA.
L’ottimizzazione di tempo e costi è perseguita interrompendo il cammino verso livelli di maggiore complessità ogniqualvolta vi sia accordo tra i tre filoni di indagine.
Per consentire la comprensione dell’approccio verrà data una breve descrizione di ciascuno dei tre settori.
LINEA DI EVIDENZA CHIMICA (OGGETTO DEL PRESENTE LAVORO)
1) determinazione delle concentrazioni totali dei contaminanti di interesse e confronto con valori soglia (se presenti);
2) determinazione delle concentrazioni dei contaminanti di rilievo dopo estrazione (stima grossolana della biodisponibilità);
3) determinazione delle concentrazioni con varie tipologie di estrazione per meglio valutare la biodisponibilità;
4) valutazione del bioaccumulo su specie target.
LINEA DI EVIDENZA ECOLOGICA
1) valutazione generale della struttura e del funzionamento dell’ecosistema in esame; 2) valutazione più approfondita della funzionalità dell’ecosistema;
3) stima dei possibili impatti della contaminazione a livello di popolazione e comunità:
4) monitoraggio di dettaglio delle biodiversità stagionali e studio approfondito dell’intera catena trofica.
LINEA DI EVIDENZA ECO-TOSSICOLOGICA
1) test di tossicità acuta con endpoint letali, effettuati su organismi semplici (sovente questi kit per test di tossicità sono presenti in commercio);
2) test di tossicità con endpoint sub-letali su organismi semplici;
3) test di tossicità con endpoint sub-letali su organismi più complessi ed utilizzo di biomarker; 4) test di tossicità con endpoint sub-letali su organismi complessi ed uso di biomarker effettuati in
situ (organismi sentinella trapiantati).
Come si evince dalla lista, l’uso dei biomarker si rivela fondamentale per ottenere informazioni di dettaglio ed attendibili sugli effetti di contaminanti su organismi ed andrebbe operato anche nei primi livelli di uno screening eco-tossicologico.
La direttiva 2008/56/UE (Marine Framework Strategy Directive) per la prima volta ne prevede l’utilizzo ai fini del bioassessment.
Tali indicatori biochimici, fisiologici, istologici e genetici sono infatti estremamente specifici e caratteristici del modus operandi di determinate classi di sostanze, considerando l’effetto su bersagli tipici della molecola, a differenza dei più rudimentali bioassays.
La produzione di un effetto tossico o comunque di un effetto che alteri la normale omeostasi dell’organismo da parte di un contaminante si sviluppa su diversi livelli gerarchici, dei quali
l’immobilizzazione o la morte sono solo l’ultimo e più evidente gradino.
Si può giungere ad essa mediante alterazioni a livello genetico, variazioni nell’espressione di proteine, alterazioni istopatologiche e del sistema immunitario ed i biomarker consentono di valutare l’esposizione ad una sostanza o i suoi effetti a questi livelli.
Inoltre essi consentono di determinare l’effetto sinergico di più contaminanti presenti in ambiente sotto soglia o gli effetti di esposizioni avvenute in passato, anche se ora il contaminante non è più presente.
Il grosso limite attribuibile ad essi è l’ottenimento di risultati a livello di individuo e non di popolazione o comunità; per questo, mediante l’uso di biomarker è solo ipotizzabile una variazione a livello di organizzazione ecologica superiore, ma questo non può essere suffragato da dati certi. La linea di evidenza ecologica fornisce di sicuro risposte complete e di grande qualità da questo punto di vista, con l’handicap però di comportare tempi lunghissimi per essere messa in atto.
La relativa novità di un approccio di questo tipo non consente ad oggi di avere una mole di dati di dimensioni soddisfacenti e questo ha portato la U.S. E.P.A. a dichiarare l’assenza di evidenze riguardo ad implicazioni per l’ambiente o per la salute umana da parte di residui farmaceutici presenti in ambiente.
Recenti studi, d’altro canto, hanno dimostrato significativi effetti di residui farmaceutici su organismi viventi e questo già alle bassissime concentrazioni (ppt) alle quali essi si trovano nelle matrici ambientali habitat di tali organismi.
Si riporteranno i risultati di alcuni di questi studi a titolo di esempio.
Il 17-α-etinilestradiolo, ormone estrogeno presente nei farmaci anticoncezionali, è stato osservato comportare femminilizzazione di pesci e rane già a concentrazioni di 1 ng/l (Kidd et all. 22),
un’azione di interferenza a livello endocrino (EDC); il diclofenac inoltre, principio attivo di numerosi antidolorifici commerciali, a concentrazioni di 100 ng/l determina danneggiamento dei reni di alcune specie di pesci e dell’apparato osmoregolatorio nel granchio Carcinus Maenas (Waring et all. 23).
Altri studi, condotti dalla università del Wisconsin (Klaper et all. 24), in questo caso sulla fluoxetina,
antidepressivo inibitore della ricaptazione della serotonina, dimostrano come popolazioni di ciprinidi esposte a concentrazioni intorno ai 100 ng/l siano profondamente danneggiate a livello di competizione intraspecifica, impiegando molto più tempo nella cattura di prede e tendendo a riprodursi in maniera significativamente minore.
L’università di Umea (Fick et all. 25) ha invece dimostrato come il norgestrel, ormone femminile
progestinico presente anch’esso in farmaci anticoncezionali, comporti a concentrazioni ambientali femminilizzazione di individui di trota arcobaleno, la cui fertilità viene in questo modo compromessa.
Altre gravi implicazioni, in questo caso per la salute umana, sono la selezione di ceppi batterici antibiotico-resistenti ad opera di residui di antibiotici in ambiente; tali specie mutanti (mutazioni a livello di genotipo premiate in termini di successo evolutivo) vengono chiamate “superbugs” e, anche se finora l’opinione pubblica non sembra esserne a conoscenza, è auspicabile che non passino alla cronaca per deleterie epidemie.
Si annoverano tra di esse lo Staphilococcus Aureus e la Pseudomonas Aeuriginosa (Kummerer et all. 26), responsabili di infezioni intestinali, delle vie respiratorie, dell’apparato muscolo-scheletrico
e del sistema nervoso.
Un modello teorico che si è diffuso nell’ultimo decennio, sviluppato dai ricercatori dell’università texana di Baylor 27, è il Fish Plasma Model.
Quest’ultimo si propone, tramite numerose assunzioni che verranno esposte, di valutare il rischio che residui farmaceutici eventualmente presenti nella matrice ambientale in cui vivono pesci (il modello è stato sviluppato tramite studi sulla trota arcobaleno) possano esplicare effetti avversi su di essi, ovvero specie “ non target “.
Esso si basa sull’assunto che i meccanismi farmacodinamici/tossicodinamici siano estremamente simili tra i mammiferi, in particolare l’essere umano per cui tali farmaci sono ideati, sintetizzati e commercializzati, ed i pesci presenti nell’ambiente potenzialmente contaminato; in particolare si presuppone che le interazioni dei principi attivi con i recettori ormonali dei loro pathways di azione siano le medesime.
Rapportando le concentrazioni della sostanza considerata nel sangue umano di persone che assumono una dose terapeutica del farmaco (HtPC - Human Therapeutic Plasma Concentration) a
quella misurata nel plasma dei pesci analizzati (FPC - Fish Plasma Concentration), si calcola l’ER (Effect Ratio).
ER = HtPC / FPC
Qualora il rapporto sia minore di uno il modello presuppone l’insorgenza di meccanismi tossicodinamici nei pesci in tutto e per tutti simili a quelli umani.
Una variante del modello 28 prescinde dalla misura diretta delle concentrazioni plasmatiche ittiche,
ricavando direttamente il dato dal coefficiente di ripartizione ottanolo - acqua, indice di lipofilicità della sostanza:
BCF (Bioconcentration Factor - concentrazione nel plasma rapportata a quella ambientale) = log (FPC / EC) = 0,73 * logKow - 0,88
Dal momento che l’omologia tra pesci ed umani a livello di recettori target dei principi attivi studiati (oltre 500) non supera il 50 % - 60 %, il modello è affetto in molti casi da una sovrastima dl rischio reale per le popolazioni ittiche dell’ambiente considerato.
Inoltre la determinazione della concentrazione plasmatica senza misura diretta, a partire dal coefficiente di ripartizione ottanolo - acqua e dunque da proprietà fisico - chimiche si rivela valida solamente per sostanze apolari (logKow > 4).
Come sottolineato, la ricerca è solamente all’inizio e tra qualche decennio saranno sicuramente note implicazioni più numerose e gravi per l’ambiente e la salute; questa considerazione ci impone di non sottovalutare la materia ed infatti, anche a livello legislativo e normativo, nonchè di linee guida qualcosa si sta muovendo, anche se a piccoli passi, come verrà sviluppato nel paragrafo seguente.