Incubazioni al buio e alla luce di carote di sedimento nudo e vegetato

In laboratorio ogni microcosmo è stato estruso dalla carota ed è stato rivestito da uno strato di carta di alluminio al fine di mantenere al buio il sedimento. Tutti i microcosmi sono stati quindi reintrodotti nelle carote di plexiglass trasparente (8 cm di diametro, 1 microcosmo per carota per un totale di 16 carote di controllo e 16 con piante) e posizionati e sommersi con acqua del sito in una vasca di incubazione alla temperatura in situ (primavera 17°C; estate 24°C; autunno 14°C). Durante la fase di pre-incubazione (12 ore) l’acqua della vasca è stata ben areata attraverso un sistema di tubi e di pompe al fine di evitare la stagnazione della stessa nelle carote e promuovere una buona ossigenazione dei sedimenti. Ciò è stato garantito anche dall’utilizzo delle barrette magnetiche teflonate all’interno delle carote, fatte ruotare ad una velocità di circa 40 rpm da un sistema di magneti guidati da un motore esterno. Come riportato nel paragrafo precedente si sono effettuate 3 incubazioni intervallate da fasi di preincubazione di 12 ore e di ricambio dell’acqua nella vasca per stimare il metabolismo bentico, i tassi di denitrificazione accoppiati alla nitrificazione ed i tassi di azotofissazione.

3.3.2.3.1 Metabolismo bentico

La metodica di incubazione è già stata riportata nel paragrafo 3.2.2.1, qui si riportano alcune differenze. I tempi iniziali sono stati prelevati all’interno della vasca (5 t0) e i tempi finali direttamente nelle 16 carote (16 tf). Le ore di incubazione sono variate in base alla stagione al

fine di ottenere concentrazioni finali di ossigeno che fossero circa il 20% del valore iniziale:

3-5 ore in primavera, 3 ore in estate, 4-5 ore in autunno. L’incubazione al buio su 4 controlli e 4 carote con pianta è stata effettuata contemporaneamente a quella alla luce, sempre su 4 controlli e 4 carote con piante, rivestendo le carote con carta di alluminio. Le incubazioni alla luce sono state eseguite usando lampade alogene riproducenti la radiazione media giornaliera del periodo di campionamento: ~600 µE m^-2 s^-1 in primavera; ~1100 µE m^-2 s^-1 in estate;

~300 µE m^-2 s^-1 in autunno. Oltre agli scambi all’interfaccia acqua-sedimento dei gas e dei nutrienti azotati disciolti, si è misurato anche il flusso del fosforo reattivo solubile e del metano.

3.3.2.3.2 Denitrificazione accoppiata alla nitrificazione

La seconda incubazione è stata realizzata sullo stesso set di carote e nelle stesse condizioni dell’esperimento precedente: 8 carote rivestite di alluminio per la simulazione del buio, 4 controlli e 4 con pianta, e 8 carote sottoposte alla radiazione luminosa, 4 controlli e 4 con pianta. La metodica utilizzata è una versione modificata dell’IPT, nella quale si assume che il nitrato che alimenta il processo di denitrificazione a diversi centimetri al di sotto della superficie del sedimento è prodotto dal processo di nitrificazione all’interno del sedimento stesso e quindi che l’ossigeno richiesto per la nitrificazione potrebbe, a questa profondità, non provenire per diffusione dalla superficie ma essere rilasciato dall’apparato radicale della macrofita. L’aggiunta di ¹⁵NH4+ permetterebbe quindi di quantificare la formazione di ¹⁵N2

dal processo accoppiato nitrificazione-denitrificazione. Dopo avere sostituito l’acqua della vasca e averne abbassato il livello qualche centimetro al di sotto della superficie della carota sono stati estrusi uno per volta i microcosmi dalle carote ed è incominciata la fase di iniezione di ¹⁵NH4+. Attraverso una siringa di vetro è stato iniettato un volume di 250 µl di soluzione anossica 10mM di ¹⁵NH4Cl (98 atom % ¹⁵N) in ognuno dei 36 setti siliconati del microcosmo per un totale di 90 µM (9 ml), facendo attenzione a prelevarla molto lentamente per evitare la formazione di bolle di gas (fig. 3.2). Ogni microcosmo è stato quindi rivestito con carta di alluminio e reintrodotto nella vasca di incubazione all’interno della carota di plexiglass. Le operazioni di recupero e di rimmersione dei microcosmi sono state compiute con delicatezza al fine di evitare la risospensione del sedimento superficiale una volta a contatto con l’acqua.

Dopo circa 15 minuti dall’iniezione, è iniziata l’incubazione tappando le carote con tappi di plexiglass trasparenti a tenuta di gas in modo da avere uno sfasamento temporale tra una carota e l’altra. Anche in questo caso il tempo di incubazione è variato in base alla stagione:

7-9 ore in primavera; 4-5 ore in estate; 5-6 ore in autunno.

NO

-NH

15

NH

C

H

Radial Oxygen Loss

15NH4++O₂ ¹⁵NO3

-O₂ O₂

O₂

O2

O₂ O₂ O2

O2

CH4+O₂ CO2 14NH4++O₂ ¹⁴NO3

-28N229N230N2

? CH

? N

O

O

O

O

? ^{O 2}

NO

-NH

15

NH

C

H

NO

-NH

15

NH

C

H

Radial Oxygen Loss

15NH4++O₂ ¹⁵NO3

-O₂ O₂

O₂

O2

O₂ O₂ O2

O2

CH4+O₂ CO2 14NH4++O₂ ¹⁴NO3

-28

Radial Oxygen Loss

15NH4++O₂ ¹⁵NO3

-O₂ O₂

O₂

O2

O₂ O₂ O2

O2

CH4+O₂ CO2 14NH4++O₂ ¹⁴NO3

-28N229N230N2

? CH

? N

O

O

O

O

? ^{O 2}

Figura 3.2 Iniezione di ¹⁵NH4+ o C2H2 in ognuno dei 36 setti siliconati.

Il termine dell’incubazione ha previsto la distruzione delle 16 carote-microcosmi mescolando acqua e sedimento per generare uno slurry. Un’aliquota dello slurry è stata trasferita in vial a tenuta di gas di 12.5 ml con l’aggiunta di 200 µl di ZnCl2. E’ stato inoltre prelevato un campione d’acqua dalla vasca di incubazione, avvelenato anch’esso con 200 µl di ZnCl2, per la determinazione della composizione isotopica dell’N2 in situ. I campioni, conservati al buio a 4°C, sono stati analizzati presso il National Environmental Research Institute, Department of Marine Ecology, Silkeborg (Danimarca), mediante gas-cromatografia accoppiata a spettrometria di massa, per la stima della composizione isotopica dell’N2 prodotto per denitrificazione.

Le carote contenenti microcosmi con 3 o 4 individui di Vallisneria sp. sono state filtrare su setaccio da 0.2 cm. Le foglie e le radici di ogni carota sono state quindi risciacquate con acqua del sito, seccate separatamente in stufa a 50° C fino al raggiungimento di un peso costante;

successivamente sono state macinate per la determinazione del contenuto elementare del carbonio e dell’azoto e per l’analisi delle firma isotopica dell’¹⁵N.

3.3.2.3.3 Azotofissazione

La terza ed ultima incubazione è stata effettuata seguendo il procedimento e le stesse condizioni sperimentali della precedente; in questo caso, volendo stimare i tassi di azoto-fissazione, è stata iniettata acqua bidistillata e del sito satura di acetilene. In ogni microcosmo è stato iniettato un volume di 9 ml di acqua bidistillata satura di acetilene (250 µl x 36 setti) in modo da non introdurre un’altra sorgente di nitrato nelle acque interstiziali. Prima di chiudere le carote con i tappi galleggianti per iniziare l’incubazione è stata sostituita un’aliquota dell’acqua della carota con acqua del sito satura di acetilene, al fine di ottenere una saturazione dell’acqua totale all’interno della carota del 10% (80 ml per le carote da 8 cm).

Come nell’incubazione precedente, alla fine dell’esperimento sono stati prelevati da ogni carota campioni di slurry per l’analisi di C2H4 e si sono pulite ed essiccate le piante di V.

spiralis per la stima della biomassa per carota.