3. Materiali e metodi
3.4. Vettori
3.6.1. Inizio selezione
100 ng di vettore pEXPb purificato sono stati utilizzati per trasformare 160 μl di cellule elettrocompetenti DH5αF'. La mix totale è stata risospesa in 2 ml SOC e suddivisa in aliquote da 50 μl ciascuna, alle quali è stato aggiunto glicerolo sterile per poterle conservare a -80°C (concentrazione finale glicerolo: 20%).
ll protocollo richiede che, da qui in poi, i passaggi vengano eseguiti senza interruzioni, per un totale di cinque giorni lavorativi non-stop.
3.6.2. Produzione dei fagi – 1° giorno
50 μl di DH5αF' trasformate (1.5x106 cfu) sono stati inoculati in 9,5 ml di 2xYT, 500 μl di glucosio 10% e ampicillina (100 mg/ml) e lasciati crescere a 37°C fino a O.D.600 = 0.5-0.8. La coltura risultante è stata infettata con 1011 unità di fago helper M13K07 (NEB), è stata incubata a 37°C per 45 minuti ed è stata centrifugata a 1500 g per 20 minuti a 10°C. La fase acquosa è stata eliminata ed il pellet risospeso in 10 ml 2xYT + ampicillina (100 mg/ml) + kanamicina (25 mg/ml) ed è stato incubato overnight a 28°C in agitazione per facilitare la produzione dei fagi.
3.6.3. Primo ciclo di selezione – 2° giorno
La coltura cresciuta overnight è stata centrifugata a 5000 rmp per 20 minuti a 10°C. La fase acquosa contenente i fagi è stata recuperata e messa in un nuovo tubo. I fagi sono stati fatti precipitare con l’aggiunta di PEG-NaCl e incubati in ghiaccio per 45 minuti. A seguito di una centrifuga a 5000 rpm a 10°C per 20 minuti, è stato eliminato il surnatante ed il pellet di fagi è stato risospeso in 1 ml di PBS 1X sterile.
Per effettuare il passaggio di selezione utile a ridurre i falsi positivi, ad un’aliquota da 200 μl di Micrococcus lysodeikticus, gram positivo, sono stati aggiunti 400 μl di fagi PEG-purificati saturati con l’aggiunta di latte in polvere al 2%. La mix è stata trasferita in un immunotubo, anch’esso saturato precedentemente con latte in polvere, ed incubata per un’ora in rotazione a RT. Il surnatante ottenuto a seguito di un passaggio in centrifuga di 5 minuti a 5000 rpm è stato trasferito in un nuovo immunotubo saturato con un’aliquota di batteri target (V. splendidus, nella prima selezione; V. aestuarianus nella seconda). Dopo due ore di incubazione in rotazione la mix è stata centrifugata a 5000 rpm per 5 minuti.
Per quanto riguarda il primo ciclo di panning, sono stati effettuati 5 lavaggi in PBS 1X-Tween 0.5% e 5 lavaggi in PBS 1X (ad ogni lavaggio: aggiunta di buffer e 5 minuti in centrifuga a 5000 rpm).
Per eluire i fagi di output rimasti legati alle cellule target al termine dei lavaggi è stato aggiunto 1 ml di cellule DH5αF' a O.D.600 = 0.5-0.8, messe in coltura durante il processo di lavaggio. Il processo di infezione richiede un’incubazione di 45 minuti a 37°C.
In seguito, 1 μl è stato prelevato per ottenere tre diluizioni seriali (1:1000, 1:10000, 1:100000) che sono state piastrate su Petri di 2xYT contenente ampicillina; il resto è stato infettato con 10 μl di fago helper M13K07 (incubazione di 45 minuti a 37°C) e centrifugato a 1500 g a 10°C per
20 minuti. La fase acquosa è stata eliminata ed il pellet è stato risospeso in 10 ml 2xYT + ampicillina + Kanamicina e lasciato crescere overnight a 28°C in agitazione.
PEG-Nacl: 200g/l polyethylene glycol 8000, NaCl 2.5M, DI water. Sterilized by filtration. Store at 4°C.
PBS 10X pH 7: 80g/l NaCl, 2g/l KCl, 15.56 g/l Na2HPO4-12H2O, 2g/l KH2PO4, DI water. Sterilized by autoclave.
3.6.4. Secondo ciclo di selezione – 3° giorno
La coltura cresciuta overnight è stata centrifugata a 5000 rmp per 20 minuti a 10°C. La fase acquosa contenente i fagi è stata recuperata e messa in un nuovo tubo. I fagi sono stati fatti precipitare con l’aggiunta di PEG-NaCl e incubati in ghiaccio per 45 minuti. A seguito di una centrifuga a 5000 rpm a 10°C per 20 minuti, è stato eliminato il surnatante ed il pellet di fagi è stato risospeso in 1 ml di PBS 1X sterile. Un’ulteriore centrifuga a velocità massima è stata effettuata per eliminare possibili batteri rimasti.
Ad un’aliquota di batteri target in soluzione sono stati aggiunti 400 μl di fagi PEG-precipitati saturati con 200 μl di latte in polvere 2%. La mix è stata trasferita in un immunotubo, anch’esso saturato precedentemente con latte in polvere, ed incubata per due ore in rotazione a RT.
Per quanto riguarda il secondo ciclo di panning, sono stati effettuati 8 lavaggi in PBS 1X-Tween 0.5% e 8 lavaggi in PBS 1X (ad ogni lavaggio: aggiunta di buffer e 5 minuti in centrifuga a 5000 rpm).
Per eluire i fagi di output rimasti legati alle cellule target al termine dei lavaggi è stato aggiunto 1 ml di cellule DH5αF' a O.D.600 = 0.5-0.8, messe in coltura durante il processo di lavaggio. Il processo di infezione richiede un’incubazione di 45 minuti a 37°C.
In seguito, 1 μl è stato prelevato per ottenere tre diluizioni seriali (1:1000, 1:10000, 1:100000) che sono state piastrate su Petri di 2xYT contenente ampicillina; il resto è stato infettato con 10 μl di fago helper M13K07 (incubazione di 45 minuti a 37°C) e centrifugato a 1500 g a 10°C per 20 minuti. La fase acquosa è stata eliminata ed il pellet è stato risospeso in 10 ml 2xYT + ampicillina + Kanamicina e lasciato crescere overnight a 28°C in agitazione.
3.6.5. Terzo ciclo di selezione – 4° giorno
La coltura cresciuta overnight è stata centrifugata a 5000 rmp per 20 minuti a 10°C. La fase acquosa contenente i fagi è stata recuperata e messa in un nuovo tubo. I fagi sono stati fatti precipitare con l’aggiunta di PEG-NaCl e incubati in ghiaccio per 45 minuti. A seguito di una
centrifuga a 5000 rpm a 10°C per 20 minuti, è stato eliminato il surnatante ed il pellet di fagi è stato risospeso in 1 ml di PBS 1X sterile. Un’ulteriore centrifuga a velocità massima è stata effettuata per eliminare possibili batteri rimasti.
Ad un’aliquota di batteri target in soluzione sono stati aggiunti 400 μl di fagi PEG-precipitati saturati con 200 μl di latte in polvere 2%. La mix è stata trasferita in un immunotubo, anch’esso saturato precedentemente con latte in polvere, ed incubata per due ore in rotazione a RT.
Per quanto riguarda il terzo ciclo di panning, sono stati effettuati 8 lavaggi in PBS 1X-Tween 0.5% e 8 lavaggi in PBS 1X (ad ogni lavaggio: aggiunta di buffer e 5 minuti in centrifuga a 5000 rpm).
Per eluire i fagi di output rimasti legati alle cellule target al termine dei lavaggi è stato aggiunto 1 ml di cellule DH5αF' a O.D.600 = 0.5-0.8, messe in coltura durante il processo di lavaggio. Al termine del processo di infezione (incubazione di 45 minuti a 37°C) 1 μl è stato prelevato per ottenere tre diluizioni seriali (1:1000, 1:10000, 1:100000) che sono state piastrate su Petri di 2xYT contenente ampicillina; il resto è stato piastrato su due piastre 24x24 cm di 2xYT + ampicillina ed incubato a 37°C overnight.
3.6.6. Raccolta dei cloni – 5° giorno
I cloni totali sono stati raccolti con 8 ml (4 ml per piastra) di acqua sterile e pellettati.
Il DNA fagmidico è stato purificato con il kit Plasmid MIDI Qiagen e quantizzato con Qubit® 2.0 Fluorometer (LifeTech). Alcune colonie sono state raccolte per un controllo random di sequenziamento Sanger, con primer VHseq, per controllare la dimensione degli inserti ed escludere contaminazioni.
3.7. Sequenziamento MiSeq
Le librerie ottenute a seguito delle selezioni su V. splendidus e V. aestuarianus sono state sequenziate mediante tecnologia MiSeq® Illumina (Illumina, Inc.) presso il Weill Cornell Medical College Epigenomics Core (NY).