Introduzione

I microrganismi durante la trasformazione dei prodotti alimentari sono soggetti a diverse condizioni di stress come ambiente acido, alte e basse temperature, stress ossidativo, stress osmotico, presenza di composti tossici ecc. (van de Guchte et al., 2002), a cui rispondono attivando meccanismi di adattamento i quali a loro volta influenzano la sopravvivenza e le prestazioni tecnologiche del microrganismo stesso.

Lo stress può essere definito come un cambiamento a livello del genoma, e del proteoma del batterio e si traduce in una diminuzione della velocità di crescita e della sopravvivenza del medesimo (Spano e Massa, 2006; Sugimoto et al., 2008).

35 I fattori di stress, possono essere di natura chimica, fisica o biologica. Alcuni sono di origine ambientale (ad esempio, temperatura, pressione osmotica, pH, concentrazione di etanolo, ossigeno disponibile, presenza di bile, antimicrobici), mentre altri possono essere autogenerati (acidità, bassa disponibilità di nutrienti come risultato del metabolismo, la generazione di specie reattive dell'ossigeno) (van de Guchte et al., 2002; Miyoshi et al., 2003; Spano e Massa 2006; Bruno-Bárcena et al., 2010).

Pertanto, sia lo stato fisiologico delle cellule sia i fattori ambientali interessanno il meccanismo di risposta allo stress. I batteri lattici hanno sviluppato sistemi di rilevamento degli stress che permettono di attivare meccanismi di difesa atti a resistere a condizioni difficili o cambiamenti ambientali improvvisi (van de Guchte et al., 2002; Spano e Massa, 2006; Lorca e Font de Valdez 2009).

Il tempo necessario affinché un microorganismo possa attivare meccanismi di difesa contro condizioni ambientali avverse dipende dalla natura dello stress. Ad esempio, i batteri rispondono più rapidamente allo shock osmotico e allo shock termico (minuti) rispetto allo shok da freddo (ore) (Wouters et al., 2001; Rosen e Ron. 2002; Spano e Massa, 2006). Inoltre la risposta allo stress si basa sull'espressione coordinata di geni che alterano i processi cellulari, come la divisione cellulare, il metabolismo, la composizione della membrana, il trasporto (van de Guchte et al., 2002). Tali risposte allo stress vengono realizzate da reti di regolatori che consentono alla cellula di reagire ai complessi cambiamenti che influenzano la sopravvivenza e la crescita cellulare.

I sistemi di resistenza allo stress possono essere suddivisi in tre classi:

(1) specifici, effetto indotto da una dose sub-letale di stress. Questa risposta adattativa è di solito associata alla fase log di crescita e comporta l'induzione di specifici gruppi di geni o regolatori concepiti per far fronte a condizioni di stress specifici;

36 (2) generali, in cui l'adattamento ad una condizione di stress può rendere le cellule resistenti

ad altre condizioni ambientali sfavorevoli;

(3) risposta allo stress associata alla fase stazionaria che comporta l'induzione di numerosi regolatori intesi a superare diverse condizioni di stress. A differenza della risposta adattativa, la risposta associata alla fase stazionaria non richiede alcuna preesposizione allo stress (Lorca e Font de Valdez, 2009) e può essere descritta come una risposta allo stress di tipo generale (Van de Guchte et al., 2002).

A volte, come nel caso di alte temperature e stress acido, possono essere presenti meccanismi multipli di risposta allo stress (van de Guchte et al., 2002; Azcárate-Peril et al., 2004). La resistenza crociata, in cui una condizione sfavorevole può rendere le cellule maggiormente resistenti ad altri stressori, è, infatti, una cosa comune tra i sistemi di resistenza dei batteri lattici, ma sembra variare tra le specie (Van de Guchte et al., 2002). In tabella 2.3 è riportata una panoramica delle diverse sollecitazioni e i meccanismi di resistenza a cui i batteri lattici sono sottoposti. Da questa tabella, si evince anche come alcuni effettori quali DnaK e GroEL giocano un ruolo centrale nella risposta allo stress.

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Stress response Reported stress cross- resistance

Stress-related resistance mechanism

Involved stress-related proteins (enzymes)

Acid stress response Two general types During log growth phase (l-ATR;

induced by nonlethal low pH) In stationary phase, induction of

general stress response

Heat, osmotic, oxidative (varies between species)

Activation of arginine deiminase pathway production of basic compounds (e.g., ammonia) ATP-dependent expulsion of protons

by proton pumps

Amino acid decarboxylation reactions and electrogenic tran sport Change in cell envelope composition Repair of damaged proteins, DNA, and

cell components

F0F1-ATPAse Two general types K+-ATPAse

Arginine deiminase Urease

Ornithine/arginine/lysine decarboxylase Lo18

Ffh

Heat shock chaperones and regulators (DnaK, GroEL; HrcA, CtsR)

recA, AP endonuclease, UvrSystem Glutathione peroxidase, glutathione reductase

Thioredoxin, thioredoxin reductase

Oxidative stress response Heat, acid, general stress resistance

Incremental expression of regulators that promote minor or global responses

Induction of heat shock proteins Reducing intracellular environment Prevention of reactive oxygen species

Formation Target protection Repair of oxidative damage

NADH oxidase Catalase Pseudocatalase Superoxide dismutase Methionine sulfoxide reductase Mannose phosphotransferase system

FLP (FNR-like proteins) RecA

Phosphate ABC transporter Cold stress response

Transient adaptive response, i.e., cold

Heat shock, freezing (cryotolerance)

Production of cold-induced proteins (CIPs) to maintain

membrane fluidity Sugar metabolism

CIPs involved in Transient adaptive response, i.e., cold

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shock response (Hpr, CcpA, b-PGM,

b-phosphoglucomutase) DNA supercoiling Chromosome

structuring (HslA) Transcription and translation

shock response b-phosphoglucomutase)

Transcription and translation Signal transduction (LlrC)

Stress adaptation (OsmC) Proteolysis of misfolded proteins (ClpX

ATPAse)

Cold shock proteins (CSPs) CspA-CspG, vary in number according to

Species

Osmotic stress response Heat shock

Exchange of compatible solutes to maintain

osmotic balance

ATP-dependent uptake system (QacT) or ABC transporter (OpuA or BusA)

(species-dependent) for uptake of glycine-betaine, carnitine, and proline during

hyperosmotic stress conditions, efflux by unidentified channel protein

Heat stress response Acid, oxidative, cold, osmotic, alcohol

Production of heat-inducible chaperones Chaperone complexes

DnaK-GrpE-DnaJ and GroES-GroEL

Production of heat-inducible proteases HtrA/DegP protease, FtsH/HflB

protease, Clp

proteases (ClpB, C, E, P, Q, X and Y), Lon

protease

Chaperone complexes DnaK-GrpE-DnaJ and GroES-GroEL

HtrA/DegP protease, FtsH/HflB protease, Clp proteases (ClpB, C, E, P, Q, X and Y), Lon

protease

Trigger factor, HrcA, HSP10, HSP23 (ClpP), HSP26, HSP33, HSP40, DnaK/HSP70, GroEL/HSP60, HSP84, HSP85, HSP100

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Tabella 2.3 - Meccanismi di risposta allo stress

Production of heat shock proteins

Bile stress response Heat

Metabolism of bile salts Bile salt hydrolase (BSH)

Adaptation to bile stress DnaK, GroEL MDR efflux

Small heat shock proteins (sHSPs), e.g., Lo18, HSP18.5, HSP18.55, HSP19.3, HSP16.4,

HSP20

Bile salt hydrolase (BSH DnaK, GroEL

Ethanol stress response Heat, acid Regulation of metabolism

Production of heat shock proteins sHSPs: HSP18

Nutrient starvation stress Response

Heat, oxidative, ethanol, acid, osmotic

Modification of cell morphology General stress proteins

Proteins involved in amino acid catabolism (carbamate kinase, putative glycine cleavage

40 Un meccanismo di risposta a condizioni avverse comune ai batteri è il cambiamento dei fattori sigma (Haldenwang 1995). In Escherichia coli e altri batteri enterici, sigma S (RpoS) è il più importante regolatore per la risposta allo stress nelle cellule. In Bacillus e Listeria, il gene implicato nell’induzione del regolatore RpoS è sigB, per la regolazione della risposta allo stress (Völker et al., 1994; Becker et al., 1998) e anche per la regolazione della virulenza di

Staphylococcus aureus (Bischoff et al., 2001). B. subtilis risponde agli stress ambientali

mediante la produzione di oltre 40 geni sotto il controllo del fattore di trascrizione σB (Haldenwang, 1995; Akbar et al., 1997) quest’ultimo comprende il gene catalasi katE, il gene che codifica per un trasportatore prolina osmoregolatore opuE, il gene clpC, il gene gtaB che codifica per una pirofosforilasi UDP-glucosio coinvolta nella sintesi del trealosio, e molti altri geni (Abee e Wouters, 1999). La differenza maggiore che esiste tra i batteri lattici e Bacillus, è l'assenza di un otologo σB, mentre sono presenti sia le diverse proteine da stress (ad esempio, DnaK, GroEL, Clp) sia i regolatori (HRCA e CTSR). Nei lattobacilli, la risposta allo stress è controllata negativamente dai regolatori HrcA e CtsR e dai sistemi a due componenti (Lorca e Font de Valdez, 2009). Un sistema di regolazione a due componenti di Lb. acidophilus, per esempio, ha dimostrato di essere coinvolto nella risposta allo stress acido e da etanolo (Azcárate- Peril et al., 2005). Dunque, non è ancora chiaro come i lattobacilli contrastino i vari fattori di stress, se attraverso i regolatori trascrizionali globali o mediante sistemi di regolazione a due componenti, o per mezzo di entrambi i meccanismi (Lorca e Font de Valdez, 2009), per questo studi di genomica e proteomica stanno contribuendo notevolmente allo studio delle interazione tra le diverse risposte allo stress (Lim et al., 2000;. Gouesbet et al., 2002;. Marceau et al., 2004;. Xie et al., 2004; Azcárate-Peril et al., 2005;. Pieterse et al., 2005;. Denou et al., 2007; Stevens et al., 2010).

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