7- STRATEGIA PER LA COSTRUZIONE DEI VETTORI
PLASMIDICI
Lo scopo del presente lavoro sperimentale era di esprimere due anticorpi recombinanti (scFv800E6; scFvADDLs) nel sistema vegetale per la loro produzione su larga scala. In particolare si voleva esplorare la possibilità che tali proteine potessero essere rizosecrete e quindi purificate in maniera più semplice e meno costosa. Per far questo è stato necessario costruire diversi vettori plasmidici (fig 18)
Il vettore di espressione pBIN19::LeExt1.1-SP/PHY-OCS (Zimmermann et al., 2003) , contenente la cassetta di rizosecrezione per il gene codificante la fitasi (PHY) è stato il punto di partenza per la costruzione dei successivi plasmidi. Il primo componente di questo grande inserto è un promotore delle cellule dei peli radicali di pomodoro LeExt1.1 (Bucher et al., 1997, 2002). La sequenza polipetidica del gene corrispondente, una volta tradotta, ha rivelato che essa è una proteina simile ad un’estensina. Le estensine sono proteine implicate in vari processi, tra cui la formazione della parete cellulare vegetale. A valle del promotore si trova una cassetta composta dal peptide segnale della β-glucanasi di orzo (Leah et al., 1991) fuso al gene sintetico di una fitasi termotollerante PHY, costruito sulla base della sequenza di 13 fitasi fungine (Lehmann et al., 2000). La β-glucanasi è un polipeptide con proprietà antifungine in quanto degrada l’ (1→3)-β-glucano delle pareti cellulari di questi organismi. Insieme alla chitina e ad una proteina che inattiva i ribosomi è stata trovata nei semi di orzo ed è responsabile con le altre della difesa della pianta dai patogeni. Il peptide segnale di questa proteina consiste di una sequenza composta da 28 residui. Immediatamente a valle del gene della fitasi si trova la sequenza terminatrice del gene dell’octopina sintetasi (OCS).
Nel presente lavoro sperimentale, il gene della fitasi è stato sostituito dai geni codificanti i scFvs di interesse.
Tuttavia essendo il plasmide pBIN19::LeExt1.1-SP/PHY/OCS difficile da manipolare sia per la sua grande dimensione (∼ 14Kb) che per la mancanza di siti di restrizione utili per l’inserimento dei scFvs, è stato deciso di trasferire l’intera cassetta nel vettore pUC19, di dimensioni più ridotte (4.5 Kb) e contenente siti unici, per manipolare in modo più agevole i costrutti. Il plasmide intermedio così ottenuto (pUC19:: LeExt1.1-SP/PHY/OCS) è stato utilizzato per sostituire il gene PHY con i geni codificanti i frammenti anticorpali scFv800E6 e scFvADDLs.
7.1 VETTORI PER LO STUDIO D’ESPRESSIONE DEL scFv800E6
Dal momento che lo studio di espressione del scFv800E6 era focalizzato esclusivamente sulla possibilità di produrre questo scFv in radice e in particolare negli essudati radicali, dopo la costruzione del vettore intermedio pUC19::LeExt1.1-SP/800E6/OCS, la cassetta di rizosecrezione contenente il scFv800E6 è stata reinserita nel pBIN19. Il vettore pBIN19::LeExt1.1- SP/800E6/OCS è stato successivamente utilizzato per ottenere piante transgeniche. Per meglio analizzare il processo d’accumulo in radice e la rizosecrezione negli essudati radicali, il gene codificante la Enhanced Green Fluorescence Protein (EGFP) è stato inserito a valle del scFv800E6 sotto il
controllo dello stesso promotore LeExt1.1. La EGFP come è noto è ampiamente utilizzata come gene reporter in numerosi sistemi.
7.2 VETTORI PER LO STUDIO D’ESPRESSIONE DEL scFvADDLs
Per quanto riguarda il scFvADDLs, lo scopo principale era verificare la possibilità che tale anticorpo potesse essere espresso in pianta e successivamente ottenere piante transgeniche per la sua produzione su larga scala ottimizzando la metodologia di produzione e sfruttando il processo di rizosecrezione. Alla luce di questo è stato necessario costruire due vettori: il vettore pBINAR::35S-SP/ADDLs/OCS, ottenuto inserendo la cassetta contenente il peptide segnale (SP), la sequenza de scFv e la sequenza terminatrice (OCS) nel vettore pBINAR, sotto il controllo del promotore 35S (promotore pseudo-costitutivo di origine virale vegetale proveniente dal promotore 35S del virus del Cauliflower; Chua et al.,1985). Questo vettore è stato utilizzato sia per la trasformazione transiente che per la stabile. Infine è stato costruito il vettore pBIN19::LeExt1.1-SP/ADDLs /OCS per ottenere la sintesi in radice e possibilmente una proteina ricombinante rizosecreta.
Figura 18: Schema dei clonaggi e subclonaggi effettuati
SP
EcorI HindIII
LeExt1.1 SP PHY OCS
pBIN19
EcorI HindIII
LeExt1.1 SP PHY OCS
pUC19 NcoI Cfr91 LeExt1.1 SP scFv800E6 OC S LeExt1.1 SP scFvADDLs pUC19
pBIN19 LeExt1.1 SP scFv800E6 OCS
EcorI HindIII XbaI XbaI pBINAR pBIN19 LeExt1 .1 scFvADDLs OCS EcorI HindIII scFv800E 6 scFvADDLs VETTORI
scFv800E6 VETTORI scFvADDLs
EcorI HindIII
NcoI Cfr91
NcoI Cfr91
LeExt1.1 S P
scFv800E6 EGFP OCS
VETTORE INTERMEDIO VETTORE INTERMEDIO
pBIN19
OCS
SP
XhoI XhoI EcorI HindIII
LeExt1.1 SP PHY OCS
pBIN19
EcorI HindIII
LeExt1.1 SP PHY OCS
pUC19 NcoI Cfr91 LeExt1.1 SP scFv800E6 OC S LeExt1.1 SP scFvADDLs pUC19
pBIN19 LeExt1.1 SP scFv800E6 OCS
EcorI HindIII XbaI XbaI pBINAR pBIN19 LeExt1 .1 scFvADDLs OCS EcorI HindIII scFv800E 6 scFvADDLs VETTORI
scFv800E6 VETTORI scFvADDLs
EcorI HindIII
NcoI Cfr91
NcoI Cfr91
LeExt1.1 S P
scFv800E6 EGFP OCS
VETTORE INTERMEDIO VETTORE INTERMEDIO
pBIN19
OCS
XhoI XhoI
8- STRATEGIE UTILIZZATE PER LA TRASFORMAZIONE DELLE PIANTE
L’espressione di proteine eterologhe nelle piante, come descritto precedentemente, può essere sia di tipo stabile (piante transgeniche) sia di tipo transiente .
Nel caso dell’espressione del scFv800E6, lo scopo era lo studio della rizosecrezione, o meglio la messa a punto di un sistema di produzione proteica in cui il scFv potesse essere accumulato in radice e secreto direttamente nel mezzo di crescita della pianta. Per raggiungere tale scopo avevamo bisogno di piante transgeniche, coltivabili in sistemi di crescita idroponica e areoponica. Tali piante sono state ottenute mediante trasformazione dei dischi fogliari con agrobatterio GV3101, in cui erano stati precedentemente inseriti il vettore pBIN19::LeExt1.1-SP/800E6-OCS e il vettore pBIN19::LeExt1.1-SP/800E6-EGFP-OCS entrambi aventi il promotore LeExt1.1 che promuove l’espressione in cellule dell’apparato radicale, e il peptide segnale SP che permette la secrezione dall’interno della cellula all’esterno, indirizzando le proteine nello spazio apoplastico.
Per quanto riguarda il scFvADDLs, la cui espressione in pianta non era mai stata ottenuta né studiata, è stato deciso di valutare entrambi i metodi di espressione, sia transgenico che transiente. Per questo, l’agrobatterio GV3101 trasformato con il vettore pBINAR::35S-SP/scFvADDLs/OCS contenente il promotore costitutivo 35S è stato utilizzato per entrambi i casi. Per l’espressione della proteina in radice è stato invece costruito il vettore pBIN19::LeExt1.1-SP/ADDLs/OCS, tale vettore sarà utilizzato in futuro per un’ulteriore trasformazione stabile delle piante.
Di seguito è mostrato uno schema riassuntivo delle trasformazioni effettuate su tessuto vegetale di diverso tipo (Fig 19)
Figura 19: Schema riassuntivo delle trasformazioni effettuate Piante transgeniche di N.tabacum Piante transgeniche di Solanum tuberosum Piante transienti di N.tabacum A.tumefaciens pBIN19::LeExt- SP/scFv800E6/OCS A.tumefaciens pBIN19::LeExt- SP/scFv800E6/EGFP/OCS A.tumefaciens pBINAR::35S- SP/scFvADDLs/OCS