Isolamento, identificazione e quantificazione dei microrganismi Isolamento

Ai fini degli isolamenti dei microrganismi in vitro, partendo da piccoli reperti di corteccia si è proceduto secondo due serie parallele di tecniche distinte, l’una per i batteri e l’altra per i funghi.

Isolamento dei batteri. Ogni campione di corteccia lesionata è stata sterilizzata

esternamente con alcool al 70% e sezionata mediante bisturi sterile per ottenere opportuni frammenti legnosi. Tutti i frammenti sono stati piastrati, previo sminuzzamento in una aliquota di acqua distillata sterile, in capsule Petri contenenti ANS (Agar nutritivo al 5 % di saccarosio) addizionato a Cicloesimide 100 ppm, per evitare la crescita di funghi, quindi posti in incubatore a 25±1 °C.

Isolamento dei funghi. Ogni lesione è stata suddivisa in strati di profondità di circa 3 mm di

spessore (ottenendo così tre strati di circa 0,5 cm l’uno) e per ogni strato sono stati esaminati 10 frammenti, per un totale di 30 frammenti per lesione.

I frammenti cosi ricavati sono stati sterilizzati superficialmente tramite immersione in perossido di idrogeno al 10% per 15 minuti, seguito da ripetuti risciacqui in acqua sterile e successivamente posti in coltura in capsula Petri contenente PDA (Potato Dextrose Agar) addizionato di streptomicina (0,06g/l) per favorire lo sviluppo degli eventuali miceli fungini presenti e la contemporanea inibizione di organismi batterici. Dopo 5 giorni di crescita a 25°C in termostato, i miceli sviluppatisi sono stati reisolati in purezza.

- Identificazione dei microrganismi isolati

Batteri. Gli isolati batterici ottenuti dagli isolamenti da materiale vegetale sono stati

raggruppati in morfotipi e quindi identificati, tramite il profilo degli acidi grassi e talora a mezzo di tecniche molecolari, consistente nell’analisi del frammento di DNA ribosomale (estrazione del DNA, amplificazione a mezzo PCR e sequenziamento delle basi).

Funghi. Gli isolati ottenuti in purezza sono stati sottoposti ad una prima suddivisione in

tipologie, basata essenzialmente su osservazioni di carattere morfologico delle colonie, quali colore, tipo di accrescimento (a circoli, a settori, omogeneo etc.), presenza di micelio aereo, eventuali fruttificazioni.

Successivamente sono state condotte osservazioni microscopiche sia allo stereoscopio che al microscopio ottico in campo chiaro:

• Osservazioni allo stereo-microscopio. Venivano condotte direttamente sulle colonie conducendo rilievi su: colore e differenziazione cromatiche; tipo di sviluppo del micelio; disegni sulla superficie; eventuali presenza di corpi fruttiferi o fruttificazioni

• Osservazioni al microscopio ottico in campo chiaro. Per quei funghi per cui non era possibile il riconoscimento con lo stereo-microscopio, si è proceduto alla osservazione al microscopio per trasparenza. All’uopo, frammenti di micelio, venivano posti su un vetrino portaoggetti, montati su di un liquido opportuno (acqua sterile, acido lattico, blu di bromofenolo, ecc.) e coperti con vetrino copri-oggetto ed indi osservati al microscopio ottico per trasparenza. In più casi si procedeva allo schiacciamento dei corpi fruttiferi al fine di far fuoriuscire conidi o spore.

Il genere e, quando possibile, la specie sono stati determinati attraverso l’utilizzo di chiavi dicotomiche dei taxa fungini secondo le indicazioni rilevate dalla letteratura (GOIDANICH, 1959,LAINER ET AL.,1978,BARNETT E HUNTER,1972,WILLIAMS E WOODWARDS,2001,VON

ARX,1987,CARMICHAEL ET. AL 1980).

In vari casi il riconoscimento delle colonie è avvenuto per confronto con colonie di riferimento precedentemente identificate e presenti nella micoteca del Dipartimento di Protezione delle Piante dell’ Università della Tuscia. Qualora fosse era possibile l’identificazione specifica nè con le chiavi dicotomiche nè tramite il confronto con altre colonie, si è proceduto con l’identificazione biomolecolare, tramite estrazione del DNA da micelio e successivo sequenziamento delle basi ottenute. Verrà di seguito riportato, seppur sinteticamente, il protocollo di estrazione del DNA utilizzato: il micelio fungino, precedentemente prelevato dalla piastra di crescita, veniva lavorato con 500 µl di 1 x TE e centrifugato per 10 minuti a 15.000 giri; il surnatante veniva scartato e l’ eppendorf dove era localizzato il pellet, sottoposta a congelamento per immersione in azoto liquido, oppure in una soluzione di alcool denaturato e ghiaccio secco. Una volta congelato, il pellet veniva sminuzzato ad opera di un mini-pestello in teflon, perfettamente aderente alle pareti interne della Eppendorf, fino ad ottenere una polvere fine; la polvere veniva risospesa in 300 µl di buffer di estrazione; quindi, per una prima precipitazione, venivano aggiunti 150 µl di sodio acetato 3 M e, dopo opportuno rimescolamento, la sospensione era posta ad incubare per 10 minuti a -20°C; dopo una ulteriore centrifugazione per 15 minuti, sempre a 15.000 giri, circa 450 µl di surnatante venivano trasferiti in una nuova provetta da 1.5 ml e il DNA veniva fatto precipitare aggiungendo isopropanolo in rapporto 1:1; seguiva una incubazione a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi il DNA veniva raccolto e successivamente centrifugato; quest’ultimo veniva lavato con 50 µl di etanolo al 70% e nuovamente centrifugato; scartato il surnatante, il pellet era lasciato asciugare all’aria per pochi minuti, il DNA così ottenuto veniva risospeso in 50 µl di 1 x TE ed infine conservato a -20°C. Al fine

possibile utilizzando due primers (brevi sequenze oligonucleotidiche) denominati ITS-1 e ITS-4, dimostratisi sufficientemente funzionali per i funghi (WHITE ET AL., 1990). Una volta

ottenuti i prodotti di amplificazione, questi venivano sottoposti a separazione elettroforetica su gel di agarosio allo 1,5% contenente bromuro di etidio in ragione di 0,6 µg/µl (MANIATIS

ET AL.,1982) in modo da riuscire a visualizzare l’effettiva riuscita del ciclo PCR (l’etidio bromuro si lega al DNA e ne permette il riconoscimento agli UV per fluorescenza). A questo punto, gli amplificati dovevano essere purificati per ripulire il DNA da sali disciolti, residui dei primers, nucleotidi liberi, enzima, ecc.; a tal scopo si è scelto di utilizzare il Kit “Nucleospin Extract” della Macherey-Nigel (M-Medical Genenco), seguendo il protocollo di purificazione da esso previsto per i prodotti di amplificazione. Le sequenze così ottenute, dopo essere state opportunamente sequenziale, e aver corretto eventuali bande dubbie confrontando le letture complementari ottenute con i 2 primers, venivano poi inserite per via telematica, tramite apposito sito internet (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/index.html), al fine di confrontarle con quelle presenti nelle più aggiornate banche dati internazionali.

In alcuni casi, per le identificazioni più difficoltose, ci si è avvalsi del servizio di riconoscimento, sia su basi morfologiche che molecolari, del CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands).

- Quantificazione delle tipologie fungine

Al fine di poter elaborare statisticamente i dati sulla presenza dei vari microrganismi, si è proceduto di volta in volta a valutare l’incidenza quantitativa delle varie tipologie fungine riferibili ai vari generi o specie.

Allo scopo sono stati tenuti in considerazione due parametri: la “frequenza di isolamento” e la “densità di isolamento”. Per “frequenza di isolamento” si intende la percentuale di isolati fungini ricavati per una determinata categoria, rispetto al numero di campioni (frammenti) esaminati. In questo caso vengono presi in considerazione anche i campioni che non hanno prodotto colonie (isolati muti). La frequenza di isolamento è indicativa della presenza nei tessuti dei vari insediamenti fungini. La “densità di isolamento” è rappresentata dal numero di isolati di una determinata tipologia fungina (genere o specie) rispetto al numero degli isolati totali ottenuti. Rappresenta l’incidenza relativa ai vari taxa fungini, considerati nei rapporti reciproci tra loro. Può risultare utile per fare dei confronti tra organi, piante e siti territoriali.