14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 2000 4000 6000 8000 10000 frazioni m cg /d l
Nella discussione i grafici sono riportati con sovrapposizioni utili ai fini delle considerazioni.
DISCUSSIONE
Le discrasie plasmacellulari sono un gruppo di patologie caratterizzate dalla proliferazione incontrollata di un clone plasmacellulare che produce una immunoglobulina intera o parte di essa. È compreso in questo gruppo l’amiloidosi AL, patologia multiorgano relativamente rara, caratterizzata dalla deposizione extracellulare di proteine fibrillari insolubili, con secondaria alterazione dell’architettura e della funzione dei tessuti coinvolti. Nell’amiloidosi AL la proteina precursore è costituita da catene leggere libere (FLC) delle immunoglobuline. È ancora oscuro il motivo per cui alcune catene leggere possono aggregarsi e dar luogo a depositi di amiloide ed altre no. Lo scopo del nostro studio è stato quello di tentare di caratterizzare biochimicamente le catene leggere libere kappa e lambda nei pazienti con discrasie plasmacellulari per individuare il loro potenziale amiloidogenico.
Siamo quindi partiti dai dati che potevamo ricavare da una estrazione di risultati dal software gestionale di laboratorio per vedere se dal punto di vista della caratterizzazione, i pazienti con amiloidosi diagnosticata potevano presentare una distribuzione dei risultati diversa da quella della popolazione normale, ma il numero dei pazienti con amiloidosi accertata era per il momento troppo limitato per tentare valutazione statistica che andasse oltre la semplice constatazione già riportata in letteratura secondo cui i pazienti con amiloidosi presentano una prevalenza di monoclonalità lambda invece che kappa. In attesa quindi di raggiungere un maggior numero di pazienti ci siamo orientati allo studio biochimico delle catene leggere, dal momento che alcuni studi segnalavano che il potenziale amiloidogenico delle catene
leggere nella amiloidosi AL poteva essere legato alla loro possibilità di aggregarsi in polimeri. Questo, associato alle segnalazioni di possibili inaccuratezze sui risultati dei test specifici per il dosaggio delle FLC proprio legate alla aggregazione in multimeri, ci ha spinti a tentare un approccio alternativo per una migliore caratterizzazione biochimica delle FLC.
Per caratterizzare dal punto di vista biochimico le catene leggere libere dei pazienti con discrasia plasmacellulare abbiamo deciso di separarle sulla base del peso molecolare e quindi quantificarle nel nostro laboratorio. Per questo abbiamo sfruttato la tecnica FPLC su una colonna per esclusione molecolare per separare le catene leggere libere da quelle che, pur libere, possono essere andate incontro a polimerizzazione. Abbiamo poi dosato sulle frazioni di interesse le catene leggere con antisieri differenti, ovvero con l’antisiero per le catene leggere libere, con gli antisieri per le catene kappa e lambda dirette contro determinanti comuni alla catene leggere libere e legate agli anticorpi. I risultati sono visibili sui grafici cumulativi.
Dalle frazioni ottenute sul primo campione (NB) proveniente da un paziente che ha monoclonalità kappa, abbiamo potuto notare che l’antisiero per FLC kappa non rileva catene leggere legate agli anticorpi, poiché non abbiamo avuto dosaggi significativi sulle frazioni contenenti proteine di peso molecolare superiore ai 100 KDa. Si può pertanto affermare che l’antisiero per catene leggere libere ha una buona specificità. Si nota anche che le FLC kappa vengono rilevate tutte al peso molecolare di 50 KDa
frazioni NB 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 5000 10000 15000 20000 25000 frazioni m cg /d l FLC mcg/dl kappa totali mcg/dl lambda totali mcg/dl FLC kappa=203,000 mg/dl FLC lambda= 0,642 mg/dl IgG=959 mg/dl IgA=35 mg/dl IgM=19 mg/dl KTot=291,0 mg/dl LTot=42,7 mg/dl
(frazioni 22 e 23) e non al peso molecolare di 25 KDa (frazione 25). Ciò non era atteso poiché nella letteratura si dichiara che le FLC di tipo kappa si ritrovano prevalentemente sotto forma di monomero (Kaplan B et Al, 2011) e non di dimeri. Per escludere la possibilità di avere disperso le catene monomero durante la procedura di separazione, abbiamo fatto la somma stechiometrica delle FLC dosate con l’antisiero specifico nelle frazioni confrontandolo con il valore delle FLC misurate nel plasma: il valore della somma risulta paragonabile a quanto misurato direttamente nel campione originario. Si deve quindi concludere che – almeno in questo campione – le catene leggere libere si presentino prevalentemente sotto forma di dimero.
Il dosaggio delle stesse frazioni con antisiero anti-‐kappa totali dimostra che tale reattivo riesce ad legare le catene kappa legate agli anticorpi, poiché il grafico dimostra un picco di reattività in corrispondenza dei pesi molecolari superiori a 100 KDa(frazioni dalla 16 alla 19) e le più piccole molecole di anticorpo circolante, le IgG, hanno un peso molecolare intorno ai 150 KDa. Ciò è in accordo con il fatto che i valori degli anticorpi complessivamente considerati in questo paziente sono presenti in discreta quantità, anche se ai limiti bassi dei valori di riferimento. Come dimostra bene il grafico, a livello dalla frazione 22 alla 24 si presenta un picco che corrisponde al peso molecolare tra 50 a 37,5 KDa e ciò significa che l’antisiero anti catena kappa è in grado di legare non solo le catene kappa legate agli anticorpi ma anche le catene leggere kappa libere, che presentano evidentemente il bersaglio antigenico esposto anche quando la catena è legata agli anticorpi. Colpisce il fatto che il picco di questo antisiero in corrispondenza delle frazioni che contengono FLC risulti quantitativamente molto più basso di quello rilevato dall’antisiero specifico per FLC, con una differenza di circa cinque volte.
In seguito abbiamo effettuato il dosaggio delle stesse frazioni con antisiero anti-‐ lambda senza specificità per le catene libere, che dimostra che il reattivo riesce ad legare le catene lambda legate ai anticorpi, infatti il grafico dimostra un picco in corrispondenza dei pesi molecolari superiori a 100 KDa, alla stessa altezza di quello delle anti-‐kappa.
Lo stesso tipo di dosaggio è stato compiuto sul campione del paziente ADS che presentava una monoclonalità lambda. I risultati sono riassunti nel grafico:
frazioni ADS 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 110000 frazioni m cg /d l FLC lambda mcg/dl lambda totali mcg/dl kappa totali mcg/dl FLC kappa=<0,027 mg/dl FLC lambda= 1160,000 mc/dl IgG=212 mg/dl IgA=26 mg/dl IgM=<18 mg/dl KTot=34,1 mg/dl LTot=225 mg/dl
Anche per questo paziente, la separazione e caratterizzazione delle catene leggere libere lambda nel campione ci consentono di rilevare la maggior parte di queste in corrispondenza dei dimeri (50 KDa), anche se in questo caso una minima quantità è dosabile anche nelle frazioni di 75 e 100 KDa (frazione 20 e 21). Potrebbero pertanto essere presenti anche polimeri di ordine superiore a due, anche se in minore quantità. Poco è rilevabile anche in questo caso sui 25 K Da. Da notare una quantità significativa di reattività con il reattivo per FLC ad un peso molecolare di 12,5 K Da che potrebbe rappresentare il peso molecolare di un singolo dominio di catena leggera. Ulteriori studi con altre tecniche sono necessari per chiarire questo aspetto. È noto in letteratura che le catene lambda libere tendono a presentarsi prevalentemente sotto forma di dimeri (Kaplan B et Al 2011), cosa quindi in accordo con il nostro dato.
Il dosaggio con antisiero diretto contro le lambda legate agli anticorpi fornisce informazioni particolari: la prima cosa che si nota è che viene rilevata anche in questo caso una reattività sopra i 100 KDa, il che significa che il reattivo riesce ad legare le catene lambda legate agli anticorpi, anche se i valori di immunoglobuline di questo paziente sono decisamente inferiori a quelli dell’altro paziente. Il reattivo conferma peraltro la sua capacità di legare le catene leggere libere presenti in quantità in questo campione, peraltro di nuovo ad un peso molecolare uguale a quello dei dimeri (come rilevato dal reattivo per le FLC). Da notare che anche con questo antisiero si rileva una reattività al peso molecolare di 12,5 KDa, rafforzando la possibilità che questa possa essere dovuta ad un singolo dominio di catena leggera. Colpisce anche in questo caso che livello di reattività dimostrato dall’antisiero che lega le catene legate agli anticorpi
risulta a livello dei dimeri sorprendentemente inferiore (circa quattro volte) a quello rilevato dal reattivo per dosare le FLC. Non è possibile con questi soli dati affermare che sia il reattivo per lambda legate che sottostima o piuttosto il reattivo per FLC che sovrastima la quantità di FLC, anche se ci sono in letteratura numerose evidenze secondo le quali il reattivo da noi usato per le FLC, può sovrastimare le catene leggere specialmente in presenza di multimeri (Tate J et Al, 2009)
Il dosaggio delle stesse frazioni con antisiero anti-‐kappa in grado di legare tutte le catene leggere kappa dimostra che il reattivo riesce a quelle legate ai anticorpi, poiché il grafico dimostra un picco in corrispondenza dei pesi molecolari superiori a 100 K Da, mentre lo stesso reattivo non riesce a legare le catene leggere libere kappa, peraltro in dosabili anche con l’antisiero specifico per FLC, poiché non compare alcun picco in corrispondenza di alcun peso molecolare inferiori ai 100 KDa.
Il presente lavoro finora illustrato rappresenta un importante passaggio per una più precisa quantificazione delle catene leggere libere, elemento che abbiamo ritenuto essenziale ai fini del migliore approccio ad una terapia efficace nei pazienti con amiloidosi. Numerose sono infatti le evidenze che l’attuale metodo di dosaggio delle FLC risenta di problematiche legate alla eterogeneità dell’analita da dosare, principalmente dovuta all’unione di monomeri, nonché di possibili frammentazioni delle catene stesse (Jenner E, 2014; Tate J et Al,2009).
L’attuale terapia della amiloidosi sistemiche consiste nella riduzione della produzione del precursore amiloidogenico circolante e, quando possibile, nella sua eliminazione. In
particolare, nell’amiloidosi AL, la riduzione mediante chemoterapia della concentrazione delle catene leggere libere amiloidogeniche circolanti si associa a un miglioramento della funzionalità cardiaca e ad un aumento della sopravvivenza (Palladini G, et Al, 2006; Lachmann HJ, et Al, 2003; Guan J et Al, 2012; Kapoor P et Al, 2012). Infatti i depositi di amiloide possono essere riassorbiti e la disfunzione d'organo può regredire se la sintesi del precursore amiloidogenico è ridotta o annullata. Pertanto, al momento attuale, lo scopo della terapia nell'amiloidosi AL è diminuire rapidamente la concentrazione delle catene leggere monoclonali circolanti tramite la soppressione del sottostante clone plasmacellulare. Si capisce pertanto l’importanza cruciale di un sistema affidabile e attendibile per la quantificazione delle FLC che possa costituire un valido strumento per il monitoraggio dell’efficacia della terapia ematologica.
Il primo studio che applica la tecnica di separazione mediante cromatografia su colonna ad esclusione molecolare è del 1994 (Myatt EA et. Al, 1994) applicando la tecnica a FLC riscontrate nelle urine di pazienti con discrasie plasmacellulari e verificando che una volta isolate andavano incontro a una associazione spontanea per formare aggregati di grosso peso molecolare quando sottoposte a particolari condizioni fisico chimiche. Abbiamo deciso di applicare anche noi questo approccio poiché offre una buona capacità di separare le FLC, combinando l’opportunità di dosarle con il reattivo specifico che nel frattempo si è reso disponibile.
Nell’approntare lo studio è emersa una singolare disparità di dosaggio da parte di antisieri diretti verso diversi epitopi e pertanto riteniamo necessario approfondire
questo aspetto poiché potrebbe condizionare pesantemente lo strumento da
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