LINEA CELLULARE CARATTERISTICHE

TEMPO DI RADDOPPIAMENTO (hr) ER MCF-7 Adenocarcinoma mammario, Differenziate, Non metastatiche 61 Risposta funzionale estrogeni positiva; mRNA per ERα mRNA per ERβ T47D Adenocarcinoma mammario, metastatiche 32 Recettori per androgeni estrogeni progesterone Ah

Tab. 1 Caratteristiche delle linee cellulari utilizzate nello studio

Lo studio si è articolato nell‟allestimento di prove funzionali in vitro ed indagini di tipo molecolare. Come modelli sperimentali validi per l‟analisi del potenziale tossico dei composti così come dell‟eventuale modulazione dell‟attività proliferativa, sono stati utilizzati vari saggi. Intraprendere uno studio sperimentale sull‟attività di una sostanza cancerogena richiede la conoscenza del potenziale profilo tossicologico e del range di concentrazioni entro il quale la si può utilizzare per approfondire e studiare gli effetti biologici. Il test di citotossicità mette in risalto gli effetti citotossici di un ampio intervallo di concentrazioni di agenti presi in esame sia singolarmente che in combinazione. Il test di vitalità consente una valutazione più approfondita e completa dell‟effetto a breve termine sulla crescita indotto dalle molecole oggetto di

studio, i tempi stabili sono 24, 48, 72 ore e 6 giorni di trattamento.

Attraverso il saggio di E-screen si mettono in evidenza possibili effetti estrogenici delle molecole in esame. Il test viene condotto in maniera analoga al test di vitalità, tuttavia con l‟accorgimento di utilizzare del siero “strippato”, in cui viene eliminata parte della componente proteica. Si utilizza il 17β-estradiolo come controllo positivo, promotore della crescita in cellule ER+, in un range di dosi estremamente ampio (0.05pM – 10nM), tale da permetterci di individuare la dose che induce l‟incremento massimale del rate proliferativo. Per il saggio vengono utilizzate linee cellulari che esprimono i recettori per gli estrogeni.

Una volta ottenuto un quadro generale sui possibili effetti delle miscele grazie ai risultati dei test funzionali, è stata valutata la modulazione da parte delle molecole e/o di miscele delle stesse sull‟espressione di geni coinvolti nella risposta ad estrogeni o a molecole diossino simili, andando ad effettuare un‟analisi di tipo molecolare con Real-Time PCR (RT-PCR), analizzando nello specifico marcatori di pathway dell‟Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) o dell‟Estrogen Receptor (ER).

La RT-PCR, denominata anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in tempo reale (rtq-PCR), è un metodo di amplificazione (reazione a catena della polimerasi o PCR) e quantificazione simultanee del DNA.

Tale tecnica, attraverso l‟impiego di una molecola fluorescente, permette di monitorare l‟andamento di una reazione ciclo dopo ciclo.

In una reazione tipica, il prodotto di PCR si raddoppia ad ogni ciclo dell'amplificazione. Il punto sulla curva in cui la quantità di fluorescenza comincia ad aumentare velocemente, solitamente alcuni scarti quadratici medi sopra la linea di base, è chiamato il ciclo soglia (valore di Ct). Il diagramma di Ct su DNA stampo è lineare, così un confronto dei valori di Ct fra reazioni multiple permette di calcolare la concentrazione dell'acido nucleico che si vuole quantificare. Il metodo utilizzato per il confronto tra trattato e controllo è quello del 2^-ΔΔCt_{. In tale}

metodo si valutano le variazioni del valore del ciclo soglia dei geni di interesse normalizzati con il gene

house-keeping GAPDH.

Tale tecnica presenta diverse applicazioni tra le quali determinare i cambiamenti nei livelli di mRNA valutando, per cellule di interesse, le modulazioni attraverso la comparazione dell‟amplificazione di un gene tra campioni sperimentali e campioni di controllo (metodo comparativo). Altro tipo di approccio è misurare l‟incremento dell‟intensità del segnale durante la fase esponenziale dell‟amplificazione andando a determinare l‟ammontare di materiale genetico presente nella fase iniziale della reazione ottenendo così una quantificazione assoluta.

L‟attività di ricerca si è poi focalizzata sull‟utilizzo della tecnica del DNA-microarray per valutare la modulazione dell‟espressione genica in risposta all‟esposizione a contaminanti ambientali. In questo modo è possibile definire i profili di espressione genica che sottendono a risposte biologiche

complesse nell‟intento di individuare biomarcatori in grado di predire il rischio per l‟uomo, e di consentire la stima di una relazione diretta tra l‟esposizione e i possibili effetti.

Per lo studio dell‟espressione genica, gli mRNA vengono prima estratti dalle cellule, convertiti in cDNA, con l‟uso di un enzima chiamato “transcriptasi inversa” e allo stesso momento marcati con una sonda fluorescente. Quando si fa avvenire l'ibridazione fra la sonda presente sulla matrice e il cDNA target, quest'ultimo rimarrà legato alla sonda e può essere identificato semplicemente rilevando la posizione nel quale è rimasto legato.

Il principio che sta alla base di questa tecnica è molto semplice e risiede nella capacità che ogni acido nucleico a singolo filamento ha di appaiarsi al suo complementare, rispettando le regole di complementarietà tra le basi: A-T, C-G.

Una volta che il microarray è stato costruito o comprato e il campione di acidi nucleici da analizzare è stato isolato, si fa avvenire la reazione di ibridazione, che permette la formazione degli etero duplex. Quindi dopo la marcatura con opportuni fluorocromi delle sequenze rappresentative dei geni in esame, i campioni possono essere depositati su supporto di varia natura (slide).

Per ottenere dei buoni microarray è essenziale difenderli dall'umidità (se l'ambiente è secco la soluzione evapora, se invece è umido si deposita dell'acqua) e dalla polvere (ogni spot è grande circa 50 micron,un granello di polvere e più grande di 50

micron, per cui può coprire vari spot), per questo motivo esistono delle camere apposite per l'ibridazione dei microarray che vengono sigillate. Dopo l'ibridazione il microarray viene lavato per rimuovere il cDNA che non si è legato.

Il vetrino a questo punto è pronto per il passaggio allo scanner dotato di laser in grado di eccitare i fluorocromi e misurarne l‟intensità della fluorescenza, fornendo quindi un‟analisi della relativa modulazione genica.

Vengono usati dei software appositi per convertire i segnali in una gamma di colori dipendente dalla loro intensità. Il segnale rilevato dallo scanner viene poi sottoposto ad altri algoritmi di filtrazione e di pulizia e convertito in valori numerici. Il principale problema dei microarray è la mancanza di standardizzazione, che causa difficoltà nel confronto di dati; inoltre, se oggi con questa tecnica è possibile analizzare i livelli di espressione di un singolo gene ottenendo degli ottimi risultati, la combinazione dello studio di molte migliaia di geni risulta molto complicato e può portare spesso a dei falsi positivi, questo accade anche a causa del fatto che alcuni cDNA possono cross-ibridare altre sonde (che avrebbero dovuto rilevare altri geni).

In ultimo, al fine di verificare l‟applicabilità di

biomarkers di espressione a situazioni di

contaminazioni reali, ci si è focalizzati su campioni estratti da matrici ambientali, ed in particolare linee cellulari di interesse sono state esposte a sedimenti provenienti da siti inquinati.

L‟approccio scelto per l‟analisi degli effetti del campione ambientale è stato esclusivamente di tipo molecolare data l‟impossibilità di effettuare i test funzionali preliminari a causa della scarsa quantità di campione stesso.