70 Figura 18. Distribuzione della frequenza della sintomatologia significativa e dei parametri di laboratorio tra gruppi di pazienti con diversi livelli sierici della MMP-9
**
71
5 DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
E’ noto che le proteasi di Trichinella presenti nell’estratto crudo o nell’antigene E/S siano degli enzimi implicati in importanti aspetti del rapporto ospite- Trichinella (Polzer and Conradt 1994; Todorova et al. 1995; Vázquez-López et al.1999). La trasformazione delle cellule muscolari scheletriche dell’ospite è pro- babilmente causata da prodotti presenti nell’E/S (Ko et al. 1994, Despommier, 1998). In particolare, glicoproteine glicosilate con il -tivelosio, di sicura origine parassitaria, sono state ritrovate nei nuclei delle cellule nurse, facendo ipotizzare un comportamento del nematode, simile a quello di un virus (Despommier, 1990). Le proteasi per esempio potrebbero essere coinvolte nel processo di ingresso delle NBL nella fibrocellula muscolare scheletrica. Di conseguenza riveste un notevole interesse caratterizzare questi enzimi con lo scopo di cercare di comprendere l’interazione ospite parassita che sussiste nella trichinellosi. Gli esperimenti di en- zcheck gelatinase/collagenase assay hanno confermata la presenza di proteasi nei prodotti E/S ed in particolare di quelle con attività gelatinolitica. Inoltre dai risul- tati degli esperimenti, in cui i prodotti E/S sono stati valutati in presenza dei due inibitori si osserva un calo di attività. Questo risultato è in linea con i dati presenti in letteratura infatti le proteasi presenti all’interno dei prodotti E/S di tutti quei pa- rassiti, che invadono i tessuti, appartengono principalmente a due famiglie: le ci- stein proteasi (inibite dalla leupeptina) e le metalloproteasi che vengono inibite dall’ EDTA, chelante dello ione metallico (McKerrow, 1989). Le analisi zimogra- fiche sono state eseguite con lo scopo di esaminare l’eventuale presenza di MMP. La differenza principale fra i protocolli che sono stati usati nei vari esperimenti di zimografia è il tipo di tampone impiegato nel refolding degli enzimi ed i tempi d’incubazione con tali tamponi, per aumentare la possibilità di evidenziare l’attività enzimatiche. Il tampone usato nel primo esperimento (1a e 1b) permette una rinaturazione generica di diversi tipi di proteasi con attività gelatinolitica, ma non è in grado di riattivare la pro-MMP-9 (Tris-HCl 100 mM pH 7). Nel secondo esperimento vengono utilizzati tre buffer specifici per le MMP. Uno permette il refolding e l’attivazione della MMP-14 (Tris-HCl 50 mM, 5 mM CaCl2, 5 mM
ZnCl2, triton 0,01%, pH 8). Le componente quali il cloruro di calcio, ed il cloruro
di zinco garantiscono una specifica rinaturazione della MMP-14, mentre il triton dovrebbe facilitare l’eliminazione dei residui di SDS. Il secondo buffer è specifico
72 per le gelatinasi (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl2 pH 7.6) ed il ter-
zo per tutte le MMP (Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM, ZnCl2 5 µg, CaCl2 5 mM,
pH 7.5). Il buffer usato nella zimografia con caseina permette la rinaturazione e l’attivazione di tutte le MMP con attività caseinolitica (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 10 mM, Triton 0,1%, pH 7,5). L’analisi mediante zimografia con
gelatina dei prodotti crudi e dei prodotti E/S, sia delle larve che degli stadi adulti di A. cantonensis, hanno dimostrato la presenza di enzimi gelatinolitici distinti. In particolare negli estratti crudi, le MMP riscontrate nelle larve L1 sono di 23 kDa, nelle larve L3 sono di 66, 42 e 30 kDa, nei giovani adulti e negli adulti sono di 72 e 94 kDa. Invece nei prodotti E/S delle larve L1 è stata evidenziata la presenza di una proteina a basso peso molecolare 42 kDa e due ad alto peso molecolare (105 and 94 kDa) con attività gelatinolitica. Nei prodotti E/S delle larve L3 è stata os- servata la presenza di tre proteine a basso (66, 50, and 30 kDa) ed una ad alto (105 kDa) peso molecolare. Gli studi d’inibizione hanno confermato che le proteine di 105 e 94 kDa di peso molecolare dei prodotti di larve L1, e quelle di 50 e 30 kDa delle larve L3 sono metalloproteasi, suggerendo che questi enzimi potrebbero svolgere un ruolo nella disseminazione del parassita (Lai et al. 2005). Noi con gli esperimenti di zimografia non abbiamo trovato nei prodotti E/S di larve L1 di T. spiralis le metalloproteasi con pesi molecolari tipici della MMP-9 e della MMP-2, riscontrate da Lai e coll. (2005). Anche l’analisi in WB con l’impiego di un anti- corpo specifico per la MMP-9 dei mammiferi non ci ha permesso di rilevare nes- suna proteina nei prodotti E/S di T. spiralis, pur allungando notevolmente i tempi di esposizione della membrana al Chemi-doc (risultati non mostrati). Anche dall’esperimento di zimografia con gelatina dei prodotti E/S dove è stato usato un buffer specifico per le MMP-9 e MMP-2 non si osserva nessuna attività proteoliti- ca. L’analisi del genoma di T. spiralis (Nematode.net; www.ncbi.nlm.nih.gov) supporta i nostri risultati dal momento che il gene di queste proteine risulta assen- te. Inoltre non è stato possibile riscontrare la presenza di MMP di altro peso mole- colare (MMP-14, -16, -17 e -20) o con attività enzimatica non gelatinolitica, come hanno dimostrato le zimografie con caseina, volte a ricercare la presenza di MMP- 20. I risultati di Lai e coll. (2005) potrebbero essere dovuti alla contaminazione dei prodotti E/S di A. cantonensis, da parte del siero fetale bovino, aggiunto alle culture dei parassiti, dal momento che risulta poco probabile una differenza così significativa tra specie filogeneticamente vicine. Risulta invece difficile spiegare i
73 risultati ottenuti con gli estratti crudi dei vari stadi di questo parassita. Alla luce di tutto ciò possiamo escludere che gli incrementi dei livelli sierici di MMP-9 e MMP-2, riscontrati nei sieri di animali sperimentalmente infettati con T. spiralis (Bruschi et al., 2014) siano dovuti ad una produzione di questi enzimi da parte del parassita, confermando l’origine esclusivamente legata alle cellule infiammatorie dell’ospite. Come già detto, nella trichinellosi l’infiammazione che si sviluppa sia durante la fase enterica che durante quella parenterale causa delle modificazioni nell’intestino e nel tessuto muscolare (Bruschi e Chiumento 2012). In particolare la miosite che si manifesta dipende dal tipo di Trichinella coinvolta, infatti se il parassita è una specie incapsulata l’infiammazione è più marcata (Bruschi et al. 2009; Bruschi e Chiumento 2011). Ancora non esistono dei marker sierologici ca- paci di valutare l’entità della miosite ed i livelli sierici di CPK/LDH sono conside- rati dei marker indiretti, essendo il risultato di un danno al tessuto muscolare (Bruschi e Dupouy-Camet 2014). Dagli esperimenti di zimografia condotti sui sie- ri dei pazienti è stato possibile rilevare l’incremento dei livelli sierici della gelati- nasi B. Gli esperimenti di WB confermano che le bande di proteolisi osservate con la zimografia sono dovute alla gelatinasi A e B. Questi risultati ottenuti hanno confermato ciò che era già stato osservato in modelli sperimentali (Bruschi et al. 2014). I livelli della gelatinasi B sono significativamente differenti fra i pazienti ed i controlli sani, dimostrado che questa metalloproteasi di matrice può rappre- sentare un valido marker di infiammazione che si riscontra nella trichinellosi cau- sata da Trichinella britovi. I livelli sierici della gelatinasi A al contrario non au- mentano nell’infezione, cosa che invece era stata osservata nei topi sperimental- mente infettati con T. spiralis dove il livello dell’enzima risulta significativamen- te incrementato a partire dalla seconda settimana di infezione e per tutta la fase parenterale. Bisogna comunque sottolineare il fatto che i prelievi ai pazienti sono stati effettuati nel momento in cui è stata fatta la diagnosi, quando la fase parente- rale non è ancora iniziata e l’infiammazione coinvolge principalmente il tratto ga- strointestinale. Inoltre questa differenza che sussiste fra le due matrixine potrebbe essere spiegata a livello di attivazione di trascrizione, infatti la MMP-9 ha un promotore inducibile da fattori di trascrizione come per esempio il NF-kB impli- cato nelle risposte infiammatorie. Al contrario il promotore della MMP-2 presenta caratteristiche più simili ad un promotore costitutivo. Questi alti livelli di MMP-9, riscontrati nei pazienti, potrebbero anche essere spiegati considerando il fatto che
74 durante l’infezione si assiste a fenomeni di rimodellamento tessutale sia a livello intestinale, dove il parassita penetra la barriera epiteliale per insinuarsi fra le cel- lule, sia a livello muscolare, momento in cui il sarcomero subisce un cambiamento fisiologico per diventare cellule nutrice. La presenza di neutrofili potrebbe anch’essa contribuire, poiché queste cellule esprimono l’enzima. I livelli sierici di MMP-9/NGAL valutati con la zimografia risultano significativamente incremen- tati nei pazienti rispetto ai controlli cosa che non era stata osservata nel modello sperimentale di trichinellosi. NGAL, anche conosciuto come l’oncogene 24p3 è una glicoproteina di secrezione di 24 kDa. Normalmente è sintetizzata come com- ponente dei granuli dei neutrofili (Chakraborty et al. 2012). Ad oggi non è possi- bile spiegare il significato biologico dell’incremento del complesso MMP-9/NGAl nei sieri dei pazienti, un’ipotesi potrebbe essere riconducibile all’attivazione dei neutrofili che si verifica durante l’infezione. Vista la correlazione significativa fra i valori della MMP-9 ottenuti con le analisi zimografiche e quelli del test ELISA è giustificato concludere che la zimografia pur essendo considerata una tecnica se- miquantitativa può essere un valido metodo per rilevare la presenza di questi en- zimi. Inoltre grazie alle informazioni ottenute dai pazienti è stato possibile osser- vare che i livelli sierici della MMP-9 sono significativamente aumentati solo in quelle persone che manifestano sintomi quali la diarrea, la mialgia e l’edema fac- ciale. Questo risultato potrebbe suggerire un possibile significato clinico dell'au- mento dei livelli sierici della gelatinasi nel gruppo di pazienti analizzati. Natural- mente questi risultati dovranno essere confermati su un numero maggiore di pa- zienti di trichinellosi, possibilmente infettati con differenti specie di Trichinella, per accertare che questo marker possa essere utilizzabile in tutti i casi di trichinel- losi, correlandolo o meno con altri parametri consolidati come per esempio gli en- zimi muscolari. Inoltre sarebbe importante valutare i livelli sierici anche in una fa- se più tardiva dell’infezione con prelievi eseguiti a distanza di vari mesi dall’inizio delle manifestazioni cliniche, quando le sintomatologie sia gastrointe- stinale che muscolare vanno risolvendosi. Solo allora sarà possibile introdurre la valutazione di questo parametro nella pratica clinica.
75
6 APPENDICE
Running buffer (1x) 1000 ml Tris-base 25 mM 3,028 g Glicina 192 mM 14.413 g SDS 0,1% pH 8.3Sample buffer per zimografia (5x)
Tris-HCl 1,25 M pH 6,8 1 ml Glicerolo 5 ml SDS 10% 4 ml Blu di bromo fenolo BBF 2,5 mg
Sample buffer per W.B. (5x)
Tris-HCl 1,25 M pH 6,8 1 ml Glicerolo 5 ml SDS 10% 4 ml Blu di bromo fenolo BBF 2,5 mg 190 µl SB(5x) + 10µl β-mercaptoetanolo
Colorante 1000 ml
Metanolo 400 ml Acido acetico glaciale 100 ml H2O bidistillata 500 ml
76
Decolorante 1000 ml
Metanolo 400 ml Acido acetico glaciale 100 ml H2O bidistillata 500ml Zimografia (E/S) Running gel 8% 10% 12% H2O bidistillata* MilliQ 4,26 ml 3,5 ml 2,7 ml Tris-HCl 1,5 M pH 8.8 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml Acrilamide 40% 2 ml 2,5 ml 3 ml bisAcrilamide 2% 1,04 ml 1,3 ml 1,6 ml SDS 10% 100 µl 100 µl 100 µl APS 10% 80 µl 80 µl 80 µl Temed 5 µl 5 µl 5 µl Stacking gel 4% 4% 4% H2O bidistillata (MilliQ) 2,96 ml 2,96 ml 2,96 ml Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 1,25 ml 1,25 ml 1,25 ml Acrilamide 40% 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml bisAcrilamide 2% 0,26 ml 0,26 ml 0,26 ml APS 10% 40 µl 40 µl 40 µl Temed 5 µl 5 µl 5 µl
*= Soluzione contenente gelatina porcina (c.f. 0,1% o 0,5%) oppure caseina (0,05% c.f.)
La caseina è stata sciolta in una soluzione 1M NaOH. Zimografia con gelatina (Sieri pazienti)
Running gel 8%
H2O bidistillata* 4,6 ml
Tris-HCl 1,5 M pH 8.8 2,5 ml
Acrilamide+bisAcrilamide 30% (29:1) 2,7 ml
77 APS 10% 100 µl Temed 6 µl Stacking gel H2O bidistillata (MilliQ) 4,1 ml Tris-HCl 1 M pH 6,8 750 µl Acrilamide+bisAcrilamide 30% (29:1) 1 ml SDS 10% 60 µl APS 10% 60 µl Temed 6 µl W.B Running gel 12% H2O bidistillata (MilliQ) 3,3 ml Tris-HCl 1,5 M pH 8.8 2,5 ml Acrilamide+bisAcrilamide 30% (29:1) 4 ml SDS 10% 100 µl APS 10% 100 µl Temed 4 µl Stacking gel H2O bidistillata (MilliQ) 4,1 ml Tris-HCl 1 M pH 6,8 750 µl Acrilamide+bisAcrilamide 30% (29:1) 1 ml SDS 10% 60 µl APS 10% 60 µl Temed 6 µl
Blotting buffer (1x) volume 1000 ml
Tris-base 25 mM 3,028 g Glicina 192 mM 14,413 g pH 8,3
78 20% Metanolo
79
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8 RINGRAZIAMENTI
Prima di tutto vorrei ringraziare il prof. Fabrizio Bruschi il mio relatore perché senza il suo supporto e la sua guida sapiente non avrei potuto raggiungere questo obiettivo. Un ringraziamento speciale anche ai miei controrelatori il prof. Aldo Paolicchi e il Dott. Graziano di Giuseppe. Mi piacerebbe inoltre spendere due pa- role per coloro che mi hanno aiutata durante il tirocinio e per la stesura della tesi: la Dott. Simona Raggi, il Sig. Stefano Mazzoni, la Dott. Simona Sagonà e il Dott. Felicioli. Li ringrazio vivamente per avermi aiutata, supportata e stimolata. Rin- grazio la Dott. Barbara Pinto che mi ha seguita nel mio percorso formativo dalla laurea triennale ad oggi. Ringrazio la Dott. Valentina Mangano per il suo inegua- gliabile entusiasmo, per la sua disponibilità nei miei confronti soprattutto nel peri- odo in cui ero a Roma.
Voglio ringraziare la mia famiglia: i miei genitori che mi hanno incoraggiata e so- stenuta nel mio studio, mia sorella Eugenia e Riccardo, i miei nonni, la mia zia Cozia e i miei cugini Marco, Rossana e Michele.