M ECCANISMI D ’ AZIONE TRA IPOTESI E CERTEZZE

Sebbene le proprietà antimicrobiche di molti estratti naturali siano state ampiamente discusse da parte di molti Autori, come accennato nei precedenti paragrafi, la letteratura appare abbastanza scarna di informazioni riguardanti i meccanismi d’azione degli estratti naturali ad attività antimicrobica.

Considerando la grande varietà di composti chimici presenti negli estratti naturali (oli essenziali ed estratti idroalcolici), appare molto probabile che l’attività antimicrobica non sia attribuibile ad un solo specifico meccanismo d’azione ma bensì a più siti d’azione a livello cellulare ( Carson et al., 2002). In Figura 2.1

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34 sono riportati i possibili meccanismi d’azione e i probabili target cellulari determinanti l’attività antimicrobica dei composti naturali. Nessuno dei meccanismi illustrati può essere considerato separatamente ma piuttosto alcuni di essi possono essere considerati come conseguenza di altri.

Figura 2.1 Possibili meccanismi d'azione e siti bersaglio dell'attività antimicrobica

Certamente una delle caratteristiche più importanti degli oli essenziali e dei loro costituenti è l’idrofobicità, proprietà chimica che gli consente di penetrare all’interno dei lipidi che costituiscono la membrana citoplasmatica e la membrana mitocondriale negli eucarioti, disturbando la struttura e le funzionalità cellulari (Sikkema et al., 1995). In seguito a questi eventi si può verificare una perdita di ioni e di altri metaboliti cellulari come descritto da Carson et al. (2002). Nonostante piccole variazioni del contenuto di ioni e metaboliti intracellulari possano essere tollerate dalla cellula batterica, se i fenomeni di deplezione di ioni e di composti essenziali per il metabolismo cellulare si protraggono nel tempo, possono causare morte cellulare (Burt, 2004). Alcuni dati a riguardo hanno evidenziato che l’effetto antimicrobico dell’olio essenziale di Melaleuca

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alternifolia (albero del thè) su cellule di E. coli può causare la morte cellulare

prima che le cellule vadano in lisi (Gustafson et al., 1998).

La struttura chimica dei singoli composti che costituiscono un estratto naturale influenza l’attività antimicrobica e determina uno specifico meccanismo d’azione (Dorman e Deans, 2000). Ad esempio, per i composti fenolici, è stata confermata l’importanza del gruppo idrossilico in relazione all’effetto inibente ma la posizione di tale gruppo funzionale a livello dell’anello fenolico non sembra influenzare l’andamento dell’attività antimicrobica, infatti, l’effetto del timolo nei confronti di B. cereus, S. aureus e P. aeruginosa è comparabile a quello esibito dal carvacrolo (Lambert et al., 2001; Ultee et al., 2002). Inoltre, alcuni dati scientifici mostrano che i meccanismi dell’azione antimicrobica del carvacrolo e del timolo, a parità di concentrazione, sono differenti nei confronti delle specie microbiche Gram-positive e Gram-negative. Mentre per i composti non fenolici l’attività antimicrobica varia in funzione del gruppo alchilico, il limonene è molto più efficace del p-cymene (Dorman e Deans, 2000).

2.3.1 AZIONE SULLA MEMBRANA

L’integrità della membrana citoplasmatica è di vitale importanza per la sopravvivenza della cellula batterica in quanto responsabile di molteplici attività biologiche fondamentali. In condizioni normali rappresenta un’efficiente barriera tra citoplasma ed ambiente esterno regolando, attraverso specifici meccanismi di trasporto, l’ingresso e l’uscita di metaboliti e ioni indispensabili per i processi biologici vitali. In condizioni di stress sub-letali, quali lievi variazioni dei fattori ambientali o presenza di sostanze ad attività antimicrobica, i batteri sono in grado

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36 di reagire sintetizzando differenti tipologie di acidi grassi al fine di variare la fluidità della membrana citoplasmatica e modificando la sintesi proteica (Mrozik et al., 2004). L’idrofobicità dei composti chimici presenti negli estratti naturali consente loro di ripartirsi all’interno del doppio strato lipidico della membrana citoplasmatica, causando alterazioni della permeabilità di membrana e del funzionamento delle proteine di membrana.

L’attività antimicrobica dell’estratto di timo nei confronti di Salmonella

typhimurium e di S. aureus è dovuto all’idrofobicità dei costituenti fenolici e alla

presenza dei legami ad idrogeno che, una volta inseritisi nel doppio strato fosfolipidico, sono in grado di legarsi alle proteine alterandone le normali funzioni (Juven et al., 1994). Inoltre, Tassou et al. (2000) hanno suggerito che il meccanismo d’azione dell’effetto antimicrobico dell’olio essenziale di menta è fondamentalmente legato all’alterazione della permeabilità di membrana e alla distruzione del sistema di trasporto degli elettroni (metabolismo energetico). Alcuni composti quali carvacrolo, carvone, timolo e trans-cinammaldeide in brodo-colture di E. coli O157:H7 provocano un incremento della concentrazione extracellulare di ATP, evento che indica un’azione distruttiva di tali molecole nei confronti della membrana citoplasmatica (Helander et al., 1998). Dall’analisi dei dati presenti in letteratura si evince che la membrana citoplasmatica appare essere il primo sito d’azione delle sostanze naturali ad attività antimicrobica, date le sue fondamentali funzioni di barriera, come conseguenza degli eventi sopra descritti si verificano tutta una serie di eventi che interessano il citoplasma e quindi l’intero sistema cellulare.

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2.3.2 AZIONE SUL CITOPLASMA

L’effetto dei composti antimicrobici naturali può interessare direttamente o indirettamente l’ambiente citoplasmatico, sede di fondamentali processi biochimici. Certamente l’alterazione della fluidità e della permeabilità della membrana citoplasmatica non restano eventi isolati ma generano a livello citoplasmatico dei fenomeni che possono influire negativamente sulla ciclo vitale della cellula batterica. Infatti, come proposto da Burt (2003), i principali effetti degli estratti naturali antimicrobici sulla cellula batterica, oltre ad interessare la membrana citoplasmatica, alterano l’equilibrio citoplasmatico causando perdita di ioni e metaboliti intracellulari, causano la coagulazione del citoplasma, provocano inibizione mediante denaturazione degli enzimi e delle proteine intracellulari.

Quando i batteri sono sottoposti ad un condizione di stress, quale la presenza di sostanze inibenti, essi generalmente incrementano la sintesi di alcune proteine definite stress proteins, heat shock proteins o HSPs (Burt et al., 2007). Le proteine HSP60 e HSP70 sono chaperon molecolari che rivestono un ruolo chiave nella sintesi di nuove catene polipeptidiche in forma lineare e per il ripiegamento e la riparazione delle proteine citosoliche (Lambert et al., 2001). La proteine HSP60 e il suo cofattore forniscono un compartimento citosolico all’interno del quale vengono ripiegate le proteine in modo tale da essere isolate e preservate. La HSP70 agisce invece a livello ribosomiale stabilizzando le catene polipeptidiche neosintetizzate (Hartl e Hayer-Hartl, 2002;Mayhew e Hartl, 1996). L’induzione della sintesi delle proteine HSP è stata ampiamente documentata su cellule di E.

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38 presenza di composti fenolici, stress osmotico ed alte temperature (Li et al., 1993; Mason et al., 1999). Inoltre un recente lavoro scientifico riporta che l’azione del carvacrolo nei confronti di E. coli O157:H7 determina un’induzione della sintesi della proteina HSP60 e inibisce la sintesi della flagellina privando quindi il batterio della sua patogenicità (Burt et al., 2007).

Quindi appare chiaro che lo studio delle proteine citoplasmatiche può rivestire un ruolo di primaria importanza nella definizione dei meccanismi d’azione dell’attività antimicrobica espressa dagli estratti naturali nonché nella definizione dei meccanismi di risposta da parte della cellula batterica in termini di suscettibilità o resistenza (Tipaldi, 2010).