MALATTIA DI VON WILLEBRAND TIPO I NEL CANE (VWI)

Introduzione

La malattia di Von Willebrand (VWD) è la più comune delle patologie ereditarie dell’emostasi nell’uomo e nel cane e patologie analoghe sono state riportate in diverse alter specie. La patologia causa degli effetti che sono diversi nelle diverse forme e che rendono complessa la diagnosi della malattia e il suo controllo. La tendenza al sanguinamento della malattia di Von Willebrand è causata da alterazioni sia ti tipo quantitativo che funzionali a carico del Fattore di Von Willebrand (VWF), una grande glicoproteina necessaria all’adesione piastrinica.

Le cellule endoteliali sono il sito maggiore di sintesi e stoccaggio del VWF. Le piastrine provvedono a produrne una seconda quota in alcune specie; tuttavia nel cane le piastrine contengono solo tracce di VWF. La vWd di tipo 1 è nella maggior parte delle razze canine, così come nell’uomo, la forma più frequente: si riscontra una carenza generalizzata, talvolta anche minima, del vWf, che però conserva la sua fisiologica struttura multimerica. Solitamente la concentrazione del vWf è minore del 50% rispetto ai valori fisiologici, ma il vWf che è presente ha una normale struttura e in vitro è in grado di sostenere il normale meccanismo di adesione piastrinica. Generalmente la gravità clinica è correlata alla riduzione della concentrazione plasmatica di vWf. La maggior parte dei cani con vWd di tipo 1 e tendenza alla diatesi emorragica, infatti, hanno concentrazioni plasmatiche di vWf minori del 20% (Brooks et al. 1992; Stokol et al. 1995).

Per quanto riguarda il Dobermann, Venta e collaboratori (2004) hanno identificato la mutazione responsabile dell’insorgenza della malattia di von Willebrand nell’ultima base dell’esone 43, ovvero nel nucleotide 7437. In particolare, la mutazione consiste nella sostituzione di un singolo nucleotide: se nella sequenza genetica fisiologica in posizione 7437 si trova una guanina, nella sequenza mutata si assiste alla presenza di una adenina (c.7437G>A).

Possono essere individuate, all’interno del tipo 1, due diverse modalità di trasmissione genetica. Per molto tempo si è creduto che fosse trasmessa in modo autosomico dominante a penetranza incompleta (Littlewood et al. 1987; Brooks 1992; Stokol & Parry 1993), mentre, dopo la caratterizzazione genica, si è verificato che ciò vale per la maggioranza delle razze canine, ma non per tutte: Dobermann, Manchester Terrier, Barboncino e Pembroke Welsh Corgi sarebbero interessate da una trasmissione autosomica recessiva (Johnson et al. 1988; Moser et al. 1996; Brewer 2000; Venta et al. 2000).

E’ bene, tuttavia, ricordare che alcuni studi successivi hanno messo in dubbio tale modalità di trasmissione per il Dobermann, riproponendo un meccanismo di dominanza a penetranza incompleta (Riehl et al. 2000; Brooks et al. 2001). Come si può notare, dunque, non si è ancora giunti ad una conclusione inopinabile e definitiva.

Figura 32: Mutazione responsabile della malattia di Von Willebrand tipo I nel Dobermann

Materiali e metodi

Disegno dei primer LAMP

I primer sono stati disegnati con l’aiuto del programma online PrimerExplorer v 4.0 (Fujitsu) utilizzando come templato la sequenza relativa all’esone 43 presente sul database GenBank. Le sequenze dei primer sono riportate nella tabella 5. Le sonde sono state acquistate da Sigma-Aldrich. I primer FIP e BIP erano purificati con HPLC.

Tabella 5

Von Willebrand tipo I – allele wild type

F3 CCAGTGCTCCCAGAAGCC B3 ACCTCAGTCCTCTCCTTCC FIP TTGCCTGCTCCAGGCAGCG-TGAGGACAACTGCCTGTCG BIP GAGAGTGGGGGAGTGGGGGT-ATCTCTGGCCCTGAACCA LF AGCCCCTCTGCTCCCCTTA LB AGGGGCAAGAGACCCCTT

Von Willebrand tipo I – allele mutato

F3 CCAGTGCTCCCAGAAGCC B3 ACCTCAGTCCTCTCCTTCC FIP TTGCCTGCTCCAGGCAGCG-GAGGACAACTGCCTGTCA BIP GAGAGTGGGGGAGTGGGGGT-ATCTCTGGCCCTGAACCA LF AGCCCCTCTGCTCCCCTTA LB AGGGGCAAGAGACCCCTT

Reazione LAMP

La reazione LAMP è stata eseguita in una mix contentente: 2.5 µl di 10X ThermoPol Reaction Buffer (New England BioLabs), 6mM di MgSO4, 1 mM di dNTPs (250 µM each), 8 U di Bst DNA polimerasi (New England Biolabs, MA, USA), 200 nM di F3 e B3, 500 nM di LF and LB, 1,6 µM di FIP e BIP, 1.0 M di betaina (Sigma- Aldrich). Per la valutazione real-time è stato aggiunto SYBR Safe all’1X di concentrazione finale. Infine sono stati aggiunti 5 µl di gDNA ed un volume di acqua per biologia molecolare fino a raggiungere un volume totale di 20 µl.

La mix di reazione è stata incubata a 65°C per 70 minuti e successivamente a 80°C per 10 minuti al fine di terminare la reazione.

Standard di riferimento

Per la verifica del funzionamento dei primer LAMP sono stati impiegati i campioni utilizzati in uno studio precedente (Gentilini et al., 2013). Sono stati selezionati 3 soggetti, uno portatore della mutazione (wt/mut), umo omozigote con entrambi gli alleli mutati (mut/mut) e un soggetto sani (wt/wt).

Risultati

Entrambi i set di primer amplificano un prodotto. Si è deciso di mettere il nucleotide la cui sostituzione causa la malattia di Von Willebrand nell’ultima posizione del primer FIP in modo da rendere l’estremità del primer più instabile nel caso non riconoscesse l’esatta sequenza, aumentando in questo modo la specificità della reazione.

Nelle prove eseguite il set di primer specifico per l’allele wild-type amplifica anche l’allele mutato e viceversa.

Al fine di aumentare la specificità della reazione sono state utilizzate condizioni di reazione più stringenti per favorire la specificità del saggio, aumentando la betaina e diminuendo la concentrazione del primer FIP, ottenendo un miglioramento ma non una specificità sufficiente.

Inoltre sono stati disegnati dei primer FIP e BIP con dei mismatch volontariamente introdotti alle estremità dei primer per rendere più instabile il legame con la sequenza non specifica ma non sono stati ottenuti dei miglioramenti definitivi.

Figura 33: A) Amplification Plot della reazione allestita con i primer per l’amplificazione dell’allele wild-type. B) Amplification Plot della reazione allestita con i primer per l’amplificazione dell’allele mutato.

LEGENDA: vW GG: omozigote wt/wt; vW GA: eterozigote wt/mut; vW AA: omozigote mut/mut

Discussione e conclusioni

Uno degli obiettivi della nostra ricerca è stato quello di mettere a punto un saggio Point of Care per evidenziare la presenza/assenza della mutazione responsabile della malattia di Von Willebrand di tipo I (vWI) nel Dobermann.

Sono stati selezionati tre soggetti di controllo (omozigote wild-type, eterozigote wt/mut e omozigote mutato) di cui era già stato individuato precedentemente il genotipo tramite PCR tradizionale e successivo sequenziamento. Sono stati disegnati e successivamente acquistati due set di sonde per l’amplificazione isotermica rispettivamente dell’allele wild type e dell’allele mutato.

Dopo averli utilizzati per testare i soggetti di controllo selezionati precedentemente, abbiamo constatato che entrambi i set di sonde sono poco specifici in quanto i primer per l’allele wild-type amplificano anche l’allele mutato e viceversa. Ciò è probabilmente dovuto alla tipologia della mutazione responsabile di vWI (Single-nucleotide Polymorphism).

Purtroppo al momento non è stato possibile ottenere dei saggi sufficientemente specifici e in grado quindi di discriminare l’allele wild-type dall’allele mutato.