Una delle applicazioni più interessanti del MALDI è l’ion imaging (IMS), ossia una tecnica di indagine microscopica, introdotta nel 1997, che prevede l’analisi delle molecole di interesse direttamente su un tessuto biologico; in questo modo, è possibile determinare la distribuzione spaziale e l’abbondanza relativa di proteine, peptidi, glicoproteine, lipidi, metaboliti e farmaci su una porzione sottile di tessuto biologico. [38]
A seguito della ricopertura della sezione di tessuto con una matrice opportuna è possibile acquisire i dati di massa in vari punti del campione: il fascio laser della sorgente MALDI, infatti, può eseguire dei microcampionamenti seguendo un raster definito dall’utente. Il tessuto è suddiviso virtualmente in una griglia e ogni cella della griglia, avente coordinate x e y, corrisponde ad un punto sul quale è registrato uno spettro di massa. Successivamente, attraverso un software, è possibile richiamare il
raster e selezionare una particolare specie con un certo valore di m/z dagli spetri
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scala cromatica si indica quali sono i punti dove la specie selezionata è presente con una certa intensità. Il processo è riassunto in Figura 27.
Figura 27: Schema di un esperimento di IMS [39].
L’utilità di un ion imaging tissutale è di estremo interesse per numerose ragioni, ad esempio può permettere:
l’identificazione di biomarker, ovvero peptidi, metaboliti o piccole molecole diagnostiche di un certo stato biologico (malattia, intossicazione, metastasi, etc.) del tessuto e la loro distribuzione;
l’analisi farmacocinetica, cioè la possibilità di monitorare sulla scala spazio-temporale il deposito, l’eliminazione e la degradazione di farmaci, tossine o molecole biologicamente attive nel tessuto o sulla sezione di un intero animale;
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lo studio di profili proteici e metabolici, e l’identificazione di zone sane o malate in relazione a patologie specifiche;
più analisi qualitative e quantitative in parallelo sullo stesso campione;
l’identificazione contemporanea di più proteine mediante digestione triptica in
loco.
Figura 28: Risultato finale di un esperimento di IMS [40].
Gli esperimenti di IMS possono essere generalmente eseguiti in due modalità:
profiling e imaging. Il profiling consiste nell’analizzare individualmente solo alcune aree
di interesse del tessuto, come ad esempio un gruppo di cellule con particolari caratteristiche; questa modalità è usata quando si studiano tessuti molto eterogenei, dove solamente una piccola area risulta interessante all’analisi. Gli esperimenti in modalità di imaging, invece, analizzano tutta l’area superficiale della porzione di tessuto; in questo modo, la mappa di distribuzione ionica di ogni segnale dello spettro di massa potrà essere correlata con le caratteristiche istologiche. L’immagine ottenuta (un esempio è mostrato in Figura 28) è molto utile perché permette di visualizzare facilmente la composizione del tessuto e la distribuzione delle specie al suo interno: ad esempio in un campione contenente delle cellule tumorali, se queste presentano un particolare segnale dovuto ad un certo biomarker, è possibile stabilire qual è la
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porzione di tessuto malato rispetto alla parte sana. Per poter elaborare i dati registrati e ottenere immagini ad alta risoluzione (utilizzando un laser nell’UV con lunghezza d’onda pari a 337 nm, è possibile ottenere una risoluzione spaziale di 10 µm) è necessario possedere computer potenti e software con algoritmi adatti a manipolare intelligentemente e velocemente la grande quantità di informazioni raccolte [41].
Nei protocolli di IMS il trattamento, la conservazione e la preparazione del campione, così pure l’applicazione della matrice, sono dei punti critici per la qualità e la riproducibilità dei dati spettrometrici. Il campione di tessuto, dopo la rimozione chirurgica, deve essere conservato adeguatamente a -80°C e in assenza di aria fino al momento dell’analisi, in modo da evitarne la degradazione. Le porzioni di campione devono essere tagliate in modo accurato con un micrometro criostatato; lo spessore non sembra essere importate per l’analisi poiché il laser è in grado di penetrare solo in parte il tessuto, ma in ogni caso è consigliabile non superare i 10-20 µm. La porzione di tessuto deve essere successivamente depositata su un supporto conduttivo, solitamente un vetrino drogato ITO (Indium tin oxide), e lasciata asciugare sottovuoto per circa un’ora; il tessuto, comunque, deve essere leggermente bagnato al fine promuovere la cocristallizzazione della matrice con il campione. In alcuni casi, ad esempio nell’analisi delle proteine o dei peptidi, il tessuto viene lavato con dei solventi (etanolo, isopropanolo, acetone, etc.) in modo da rimuovere eventuali specie contaminati come i sali, i lipidi e il sangue residuo [42].
Tipicamente, la matrice solida è sciolta con una soluzione di acqua/acetonitrile al 50:50 v/v e contenente lo 0.1% di TFA (in alcuni casi si consiglia di usare una soluzione più concentrata in TFA, fino al 2%, per favorire la ionizzazione). L’applicazione della matrice sul tessuto può essere effettuata manualmente, depositando delle gocce del volume di 250 nL (max 1 µL); sebbene con questo metodo si possano ottenere degli spettri di alta qualità, le macchie di matrice che si formano sono piuttosto larghe e non permettono di ottenere una risoluzione spaziale elevata (0.5-1 mm). La matrice può essere depositata anche con l’ausilio di un robot, in grado di posare volumi molto piccoli, dell’ordine di qualche decina di picolitro, e formare gocce con diametro di 100-180 µm. Altri metodi prevedono di spruzzare la soluzione di matrice sull’analita, ad esempio con l’ausilio di un aerografo; in questo caso, si devono eseguire dei cicli multipli di spruzzatura per ottenere un’applicazione adeguata della matrice. Benché in letteratura si trovino varie metodologie, la deposizione della matrice deve permettere di ricoprire il campione in modo omogeneo, evitando la traslocazione degli analiti. Infine, si deve ricordare che i cristalli che si formano devono avere dimensioni minori della risoluzione spaziale [43].
55 Attraverso l’uso di software specifici, inoltre, la qualità dello spettro può essere ulteriormente migliorata effettuando, ad esempio, la sottrazione della linea di base, la riduzione del rumore di fondo, la calibrazione e la normalizzazione rispetto alla corrente ionica totale (TIC) [44].
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