I MASTOCITI

La presenza di mastcells triptasi positive è stata valutata con l’immunoistochimica a livello intratumorale, peritumorale ed extratumorale; dei 100 casi analizzati, 25 (25%) risultano essere triptasi positivi. Più nel

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dettaglio sono risultati 27 casi con infiltrazione mastocitaria intratumorale, 36 con infiltrazione peritumorale e 4 con infiltrazione della regione extratumorale. La presenza di mastcells appare significativamente correlata (p=0,0073) con l’assenza della capsula tumorale. Non è presente, invece, una correlazione tra i mastociti e l’infiltrazione della capsula tiroidea. Per quanto riguarda le altre caratteristiche clinico-patologiche quali l’istotipo, la bilateralità, la dimensione tumorale e la presenza di metastasi linfonodali non è stata riscontrata alcuna significatività statistica. Esiste al contrario una diretta proporzionalità (p=0,0133) con la multifocalità tumorale.

Tra la presenza di mastcells triptasi positive, l’età e il sesso dei pazienti presi in esame non vi è alcuna correlazione statisticamente significativa.

Inoltre, non si è riscontrata una diretta relazione tra i macrofagi CD68 positivi e le mast cell intratumorali (p=0,0566), sebbene l’andamento dei dati statistici sia apparentemente orientato verso una proporzionalità inversa; non è presente correlazione statisticamente valida neanche tra infiltrato mastocitario e presenza di tiroidite linfocitaria.

Per quanto riguarda la relazione con le chemochine è stata riscontrata la presenza di una proporzionalità inversa (p=0,0065) rispetto all’espressione di CXCL10, cioè nei casi in cui l’espressione di CXCL10 è maggiore quella di triptasi risulta minore e viceversa.

In modo interessante esiste una significativa correlazione tra i mastociti e la presenza di mutazione V600E del gene BRAF (p=0,0416).

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Non esiste invece associazione statisticamente significativa tra mastociti triptasi positivi e riarrangiamento RET/PTC (anche a causa dello scarso numero di traslocazioni riscontrate nei campioni analizzati).

Nei 21 casi controllo la presenza di mastociti risulta virtualmente assente.

9.4 I Macrofagi

La presenza di macrofagi CD68 positivi è stata valutata su base immunoistochimica a livello intratumorale, peritumorale ed extratumorale; dei 100 casi analizzati, 82 (82%) risultano essere CD68 positivi, così suddivisi: 81 casi con infiltrato intratumorale, 49 con infiltrato peritumorale e 27 casi con localizzazione macrofagica extratumorale.

Si riscontra una proporzionalità inversa (p=0,0334) tra la presenza di infiltrato macrofagico e le dimensioni della neoplasia. Anche con la bilateralità tumorale c’è una correlazione inversa (p=0,0072). Non risultano invece correlate alla presenza di macrofagi CD68 positivi i seguenti aspetti clinico-patologici: l’età, il sesso dei pazienti, l’istotipo tumorale, il riscontro di aree tumorali poco differenziate, la presenza della capsula tumorale, l’infiltrazione della capsula tiroidea, la multifocalità, le metastasi linfonodali.

La correlazione tra macrofagi CD68 positivi e la presenza di tiroidite linfocitaria è statisticamente significativa (p=0,0043): all’aumentare della densità macrofagica, aumenta anche quella dell’infiltrato linfocitario. Non è stata osservata significatività statistica tra macrofagi e mastcells triptasi positive, come tra i macrofagi e l’espressione di CXCL10.

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Infine anche l’associazione con la presenza della mutazione di BRAF e del riarrangiamento RET/PTC non risulta essere statisticamente valida.

Nei 21 casi controllo la presenza di macrofagi risulta virtualmente assente.

9.5 CXCL10

L’espressione immunoistochimica di CXCL10 risulta significativamente correlata all’istotipo del carcinoma papillare (p=0,000006), cioè si ha espressione maggiore nelle varianti follicolari. CXCL10 è inversamente proporzionale (p=0,02) alla presenza di aree tumorali poco differenziate, così come è inversamente correlata (p=0,0222) alla bilateralità dei tumori. Non sono invece statisticamente correlate all’espressione di CXCL10 la dimensione della neoplasia, la presenza della capsula tumorale, l’infiltrazione della capsula tiroidea, la multifocalità e la presenza di metastasi linfonodali.

La correlazione tra l’espressione di CXCL10, l’età e il sesso dei pazienti non è risultata statisticamente significativa, mentre risulta direttamente correlata (p=0,0065) alla presenza di mastociti. Non si riscontra correlazione con l’infiltrato macrofagico.

Considerando l’associazione tra l’espressione immunoistochimica di CXCL10 e la presenza di tiroidite nelle diverse sedi risulta che CXCL10 correla significativamente ed in modo inverso con la sola tiroidite linfocitaria peritumorale (p=0,0233).

Correla inoltre in modo significativamente inverso (p=0,04) con la mutazione di BRAF, non correla con il riarragiamento RET/PTC3.

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Considerando invece l’espressione molecolare di CXCL10 con la tiroidite linfocitaria si osserva che esiste una significativa proporzionalità diretta tra la chemochina e la tiroidite peritumorale (p=0,00011), intratumorale (p=0,000285) ed extratumorale (p=0,000831). Una diretta proporzionalità con la mutazione di BRAF (p=0,0056)

Ma soprattutto, in modo sorprendente, si è osservato che esiste una correlazione inversa tra l'espressione di CXCL10 immunoistochimica e la sua controparte molecolare (p= 0,006).

In conseguenza a questa osservazione abbiamo suddiviso i casi con tiroidite linfocitaria (in tutte le sue localizzazioni) da quelli senza tiroidite. Questo per cercare di evidenziare il reale significato del CXCL10 sul tumore, significato non mediato dalla presenza di cellule linfocitarie.

Nei 39 casi risultati completamente privi di tiroidite linfocitaria l’espressione immunoistochimica di CXCL10 non correla ancora significativamente con l’espressione dell’mRNA della stessa chemochina anche se l’atteggiamento tende alla significatività (p=0,059).

Non esiste correlazione statisticamente significativa tra l’espressione dell’mRNA di CXCL10 e la presenza di mutazione V600E di BRAF (p=0,051). Esiste invece significativo rapporto tra mRNA di CXCL10 e l’infiltrazione della capsula tiroidea (p=0,038). Il rapporto con gli altri parametri non risulta significativo.

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I rapporti dell’espressione immunoistochimica di CXCL10 nei 39 casi privi di infiltrato infiammatorio rimangono similari a quelli risultati tra dell’espressione immunoistochimica di CXCL10 e casistica completa di casi con tiroidite. Nei 21 casi controllo la l’espressione immunoistochimica di CXCL10 risulta virtualmente assente, mentre l’espressione molecolare risulta presente ma a valori statisticamente inferiori rispetto al tumore (p=0,03).

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10. Discussione

Già da anni è stato individuato il rapporto tra infiammazione cronica e tumore in differenti tipi di neoplasia solida.

L’associazione tra tiroidite linfocitaria e carcinoma papillare della tiroide rimane tuttora controversa; sono però molti gli studi che localizzano l’infiltrato linfocitario a livello intratumorale (Kebebew, 2001) e ne sottolineano la relazione positiva con il tumore, cioè la presenza di infiltrato risulta significativamente correlata ad una prognosi migliore, con bassa frequenza di fattori prognostici negativi, come infiltrazione extracapsulare, metastasi linfonodali, multifocalità e bilateralità. Questo supporta l’ipotesi che l’infiltrato linfocitario rappresenti una forma di risposta immunitaria nei confronti del tumore e ne condizioni in qualche modo la crescita e la proliferazione (Lho, 1999). Simili osservazioni sono state effettuate sia su adulti che su bambini ed adolescenti (Gupta, 2001). Su questi ultimi si è cercato anche di caratterizzare il tipo di infiltrato linfocitario osservando che: frequentemente sono presenti linfociti TCD4+ (43%), TCD8+ (38%), TCD19+ (48%), tutti e tre + (24%) e TCD56+ (5%); non è stato ad ora possibile caratterizzare l’espansione clonale della popolazione linfocitaria esaminata (Modi, 2003).

La diffusione dell’infiltrato infiammatorio in altri tipi di tumore solido, soprattutto maligni, è stata studiata in modo più approfondito ed è stata ampiamente dimostrata la presenza di infiltrati linfomonocitari coinvolti nella risposta immune dell’ospite ( Smyth MJ, 2001; Shankaran V, 2001).

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La capacità sia dell’immunità acquisita che di quella innata di interferire con la crescita e la diffusione di una neoplasia è stata osservata in diversi modelli animali (Prdoll, 2001; Lanier LL, 2001) e, più recentemente, anche in pazienti umani dopo somministrazione di un vaccino tumore-specifico (Banchereau J, 2001). Nonostante l’acquisizione di queste nuove conoscenze, il ruolo della risposta immunitaria nel controllo della genesi e della progressione neoplastica, è ancora scarsamente documentato.

Anche nei carcinomi tiroidei, in particolare nei carcinomi papillari, la presenza di infiammazione cronica è stata a lungo studiata sia in modelli murini modificati sia nell’uomo (Rhoden et al. 2006; Pufnock e Rothstein, 2009). E’ stato inoltre possibile osservare una risposta infiammatoria in cellule tiroidee normali dopo induzione di espressione di oncogeni specifici del PTC; questa risposta infiammatoria coinvolge

numerosi e differenti mediatori.

Il carcinoma papillare, sebbene risultato da molti studi strettamente correlato all’infiltrato linfocitario, non correla in modo ugualmente forte con la presenza di tiroidite autoimmune, lasciando presupporre l'azione differente, ma sincrona di diverse classi di linfociti (Fiore et al. 2009) oppure l'azione sinergica di diverse molecole, quali citochine, chemochine o altri mediatori dell'infiammazione.

La presenza di mastociti nel carcinoma papillare tiroideo è gia stata dimostrata da Melillo et al. nel 2010. Secondo questi autori i mastociti tendono a disporsi perifericamente al tumore, sul fronte di infiltrazione; è stato inoltre osservato che la densità dei mastociti è maggiore nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti

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normali tiroidei, dove per altro sono virtualmente assenti. Ciò potenzialmente potrebbe essere dovuto sia al reclutamento di precursori di mastociti sia ad un aumento della proliferazione e della sopravvivenza di mastociti già presenti. Ryder et al. nel 2008 hanno dimostrato l'importanza dei macrofagi nel carcinoma tiroideo. Queste cellule risultano fondamentali nella progressione tumorale, sono infatti fortemente correlate al grado istologico, all'invasività del tumore ed al decremento della sopravvivenza nei carcinomi scarsamente differenziati. Il meccanismo tramite il quale i macrofagi vengono richiamati nel tumore non è ancora stato chiarito. Alcune oncoproteine coinvolte nella trasformazione cellulare potrebbero stimolare direttamente il reclutamento dei macrofagi attraverso l'espressione di chemoattrattori specifici. Anche la mutazione del gene BRAF è stata chiamata in causa suggerendo che tumori con tale mutazione fossero maggiormente predisposti ad una infiltrazione macrofagica (Mesa et al. 2006).

Indipendentemente dal meccanismo di reclutamento, i macrofagi producono diverse chemochine e fattori di crescita che possono influenzare l'espressione dei recettori per le chemochine nelle cellule tumorali (Hwang et al. 2003, Castellone et al. 2004).

Melillo et al. nel 2005 avevano già osservato, in vitro, che cellule di carcinoma tiroideo esprimono sia CXCR2 che CXCR3 sia i loro ligandi CXCL1 e

CXCL10, i quali vanno a

sostenere la proliferazione e la capacità infiltrativa delle stesse cellule tumorali nel PTC (Melillo et al., 2005). Nello stesso studio, gli autori avevano

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queste ultime incrementavano la loro proliferazione e la capacità di migrare ed invadere attraverso una membrana in Matrigel; questo suggerisce che i recettori CXCR2 e CXCR3 sono presenti sulle cellule di PTC, disponibili per legami esogeni.

Melillo et al. nel 2010 hanno ulteriormente approfondito questo studio, dimostrando che le chemochine, CXCL1 e CXCL10, sono coinvolte nell’incremento della crescita delle cellule tumorali tiroidee mediata dai mastociti.

Sulla base di queste affermazioni si è svolto il nostro studio che ha confermato in parte le evidenze già dimostrate.

E’ stato osservato che un importante infiltrato infiammatorio linfocitario, macrofagico o di mastociti risulta correlato al carcinoma papillare. Si è notata una particolare propensione dei mastociti e dei linfociti a disporsi lungo il fronte di invasione tumorale. Non solo, suddette cellule potrebbero favorire l'infiltrazione del parenchima tiroideo e per estensione ai tessuti lassi extratiroidei. Inoltre queste cellule si relazionano alla presenza di aree intratumorali di scarsa differenziazione, suggerendo un ruolo di primo piano nella progressione tumorale.

L’infiltrato infiammatorio intratumorale ed in parte quello extratumorale pare abbiano invece un opposto significato andando ad agire anche loro sul tumore, ma in modo protettivo. Nei casi con ricco infiltrato linfocitario intratumorale si ha infatti una maggiore probabilità di una neoplasia capsulata, intratiroidea e di piccole dimensioni. Rimane comunque una stretta correlazione tra questi 2 tipi di infiltrato, una minore differenziazione cellulare e la mutazione di BRAF.

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Importantissima è stata la scoperta della relazione esistente tra la tiroidite linfocitaria e l’espressione di chemochine, in particolare di CXCL10.

E’ noto dai lavori di Melillo et al. (2010) che i mastociti riescono a produrre CXCL10, la quale, tramite un’azione sinergica con altri mediatori, come CXCL1 e l’istamina, agisce sulla progressione tumorale.

In questo studio per la prima volta abbiamo correlato l’espressione di CXCL10 con la presenza di linfociti. Pare che l’infiltrato linfocitario riesca a produrre questa chemochina interagendo con il tumore e probabilmente cooperando con le citochine prodotte da altre cellule infiammatorie, in particolar modo dai mastociti.

L’ espressione molecolare di CXCL10 nei tumori con infiltrato linfocitario risulta strettamente correlata con alcuni dei più importanti fattori prognostici negativi per il carcinoma papillare tiroideo, come la mutazione del gene BRAF; questi risultati vengono del tutto sovvertiti se la stessa analisi viene effettuata su tumori privi di tiroidite. I dati ottenuti da tumori privi di tiroidite sono inoltre completamente sovrapponibili a quelli ottenuti tramite indagine immunoistochimica, dove l’espressione della proteina viene evidenziata dalla tecnica solo nelle cellule tumorali con esclusione a priori delle cellule infiammatorie collaterali.

I macrofagi nella nostra casistica non hanno un ruolo molto importante. Questo è probabilmente dovuto al fatto che i tumori analizzati sono tutti carcinomi papillari e cioè neoplasie ben differenziate. Il ruolo di queste cellule era stato dimostrato nella progressione tumorale di carcinomi scarsamente differenziati.

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11. Conclusioni

Anche nella nostra esperienza è stata dimostrata l’importanza dell’infiltrato infiammatorio nella progressione tumorale. Si è infatti dimostrato come esista un infiltrato infiammatorio tipico delle neoplasie e come questo riesca ad agire sulla progressione tumorale, producendo fattori che riescono ad interagire tra loro e con le stesse cellule tumorali.

Il CXCL10 per esempio, prodotto dalle cellule infiammatorie, agisce sulla capacità tumorale di infiltrare i tessuti circostanti. Si è però ipotizzato che questa chemochina sia solo un tramite e che la sua azione, assente in tumori aggressivi privi di infiltrazione infiammatoria, è mediata dall’azione di altri fattori.

Risultano necessari ulteriori studi ed approfondimenti per chiarire bene questi meccanismi. Lo studio dovrebbe infatti estendersi all’azione, singola e combinata, di altre chitochine e chemochine. Inoltre il ruolo dell’infiltrato infiammatorio dovrebbe essere valutato in tumori che presentano aree di minore differenziazione o completamente indifferenziati. Sarebbe infine opportuno correlare i risultati ottenuti con i dati clinici ed il follow-up dei pazienti.

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