3.1 Casistica
Un totale di 278 pazienti (153 uomini e 125 donne), affetti da sarcomi delle parti molli ad alto grado secondo l'Union for International Cancer Control (UICC) TNM Classification of Malignant Tumors e assistiti nel reparto di Oncologia dell’Istituto Ortopedico Rizzoli (IOR) IRCCS di Bologna da ottobre 1991 ad aprile 2011, con completa documentazione clinica ed istologica, è stato incluso in questo studio. I tumori primari, localizzati in profondità e con un diametro > 5cm, erano localizzati nei tessuti molli delle estremità e della parete toracica. I criteri di selezione hanno escluso i pazienti precedentemente trattati con radio e/o chemioterapia e con recidive locali alla diagnosi.
La diagnosi, basata su criteri istologici, citogenetici ed immunoistochimici secondo la “Classificazione internazionale istologica” dell’Organizzazione Mondiale della Sanità [55], è stata confermata indipendentemente da più patologi. Il follow-up è stato calcolato dalla data della diagnosi al primo evento, ovvero la comparsa di metastasi, o all’ultimo follow-up, considerando un follow-up minimo di 3 anni per i pazienti non presentanti metastasi.
I pazienti sono stati sottoposti ad un’ampia escissione locale del tumore primario.
I campioni di sangue sono stati collezionati al momento della diagnosi, senza alcuna tipologia di additivo e conservati per 2h a temperatura ambiente per permettere loro di coagulare. Successivamente sono stati centrifugati a 3,000 × g per 20 minuti a 4°C. I supernatanti sono stati prelevati e conservati a –80°C. Nessun campione è stato scongelato più di due volte prima dell’analisi.
Inizialmente, 74 sieri sono stati suddivisi in discovery (34 sieri) e validation (40 sieri) set e sono stati analizzati mediante utilizzo di nanoparticelle ed analisi di cromatografia in fase liquida abbinata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). 35 erano donne e 39 uomini con età media di 58 anni (range 18–92). 37 pazienti erano senza metastasi e 37 pazienti avevano sviluppato le metastasi, dei quali 12 alla diagnosi o nei primi 4 mesi dalla diagnosi. Il follow-up totale andava dai 5 ai 188 mesi con una mediana di 45 mesi. Il tempo alla metastasi variava da 0 a 153 mesi con una mediana di 7 mesi. 28 sieri provenienti da donatori sani sono stati utilizzati come controllo (Tabella 10).
Successivamente, la concentrazione delle proteine più significative all’analisi univariata (SERPINC1, CFHR5 e IGFBP7) è stata validata con tecnica ELISA in 59 (32 non metastatici e 27 metastatici) sieri e l’espressione tissutale di IGFBP7, a più significativo impatto traslazionale, è stata analizzata mediante analisi di immunoistochimica su Tissue Microarray (TMA) di 145 sezioni (66 non metastatici e 79
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metastatici) di campioni di sarcomi delle parti molli ad alto grado inclusi in paraffina, di cui 59 appartenenti agli stessi pazienti con il siero (Tabella 11).
Per concludere, al fine di trovare un collegamento tra proteine identificate e i microRNA principalmente correlati allo sviluppo ed alla progressione dei tumori, trovati precedentemente down- regolati in un set di SPM [54], è stata condotta la validazione di 12 miRNA in 59 campioni di sarcomi delle parti molli ad alto grado con tessuto sia congelato che incluso in paraffina. 27 erano Leiomiosarcomi e 32 Sarcomi Pleomorfi Indifferenziati, 32 uomini e 27 donne con età media di 63 anni. 33 pazienti svilupparono metastasi durante un periodo di follow-up minimo di 4 anni. Altri 10 tessuti non oncologici sono stati inclusi nello studio come controlli. L’analisi di espressione delle proteine MET e KIT, target di miR-152, che è risultato essere il più significativo, è stata valutata mediante immunoistochimica su TMA su una più ampia casistica di 86 SPM (Tabella 11).
Discovery Set Validation Set Controllo
Campioni
SPM maligni Donatori sani
No. No. No. 34 40
28
Genere
Maschi Femmine
No. No. No. 21 18 14 13 22 14
Età media – anni (range) 60 (33-92) 56 (18-92) 50 (32-73)
Follow-up totale mediano – mesi 45 (6-188) 45 (5-155) 51 (19-71)
Outcome Vivi Morti No. No. 24 20 10 20 Decorso clinico SPM non metastatico SPM metastatico No. No. 17 20 17 20
Tabella 10. Dati clinici dei pazienti con sarcoma delle parti molli (74) e donatori sani (28) analizzati mediante utilizzo di nanoparticle e spettrometria di massa (SPM = sarcomi delle parti molli).
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Il protocollo di ricerca è stato approvato dal Comitato Etico dell’Istituto Ortopedico Rizzoli e tutti i pazienti hanno fornito l’appropriato consenso informato. Il lavoro è stato portato avanti in accordo con “The Code of Ethics” of the World Medical Association (Dichiarazione di Helsinki).
ELISA, IHC (n = 59) IHC (n = 86)
Genere Maschi Femmine No. No. 32 50 27 36
Età media – anni (range) 53 (18-83) 62 (19-92)
Sede Arti superiori Arti inferiori Scheletro assile No. No. 7 15 48 65 4 6
Follow-up totale mediano – mesi 52 (5-239) 42 (3-204)
Tempo mediano alla metastasi – mesi 17 (0-187) 4 (0-98)
Outcome Vivi Morti No. No. 39 39 20 47 Decorso clinico SPM non metastatico SPM metastatico No. No. 32 34 27 52 Istotipo Leiomiosarcoma
Sarcoma Pleomorfo Indifferenziato Sarcoma Sinoviale Liposarcoma Fibrosarcoma No. No. 8 32 4 27 16 10 25 10 6 7
Tabella 11. Dati clinici dei pazienti con sarcoma delle parti molli analizzati mediante utilizzo di saggio ELISA ed immunoistochimica (ELISA = Enzyme-linked Immunosorbent Assay; IHC = Immunohistochemistry; SPM = sarcomi delle parti molli).
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3.2 Sintesi e caratterizzazione di core-shell hydrogel nanoparticles
La sintesi delle nanoparticelle con l’aggiunta di
bait
o delle esche è stata eseguita come fase di analisi preliminare, al fine di eliminare le proteine più abbondanti presenti in eccesso nel siero e concentrare lelow molecular weight proteins
e/o i peptidi derivanti da proteine più grandi e presenti in scarsa concentrazione (Figura 8) [42, 56].Figura 8. Meccanismo d’azione delle nanoparticle. A. Le esche o