5.1 Anatomia e istologia della membrana amniotica.
Le membrane amniotiche si sviluppano da tessuti extra-embrionali e sono costituite da una componente fetale (strato coriale) ed una componente materna (la decidua). Queste due parti sono tenute insieme dai villi coriali e collegate al guscio citotrofoblastico del sacco coriale alla decidua basale. La componente fetale, che include le membrane amniotiche e corionica fetale, separa il feto dall’endometrio. La membrana amniocorionica costituisce il limite esterno della sacca che racchiude il feto, mentre lo strato più interno della sacca è la MA. La MA è costituita da un monostrato epiteliale, una spessa membrana basale, ed un stroma avascolare. La MA non contiene vasi sanguigni e nervi, per cui i fluidi nutrienti che essa richiede vengono forniti direttamente per diffusione dal liquido amniotico e / o dalla decidua sottostante.
Lo strato più interno, più vicino al feto, si chiama epitelio amniotico ed è costituito da un singolo strato di cellule uniformemente disposte sulla membrana basale. La membrana basale è una delle membrane più spesse che si trovano in tutti i tessuti umani. Il sostegno fornito al feto dalla membrana basale durante la gestazione sta a dimostrare la grande importanza che ha l'integrità strutturale di questa membrana. Lo strato compatto di cellule stromali adiacente alla membrana basale costituisce la principale componente dello scheletro fibroso della MA. Il
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collagene dello strato compatto viene secreto dalle cellule mesenchimali situate nello strato fibroblastico.
Il collagene interstiziale (tipo I e III) predomina e forma fasci paralleli che consentono di mantenere l'integrità meccanica di MA. Il Collagene di tipo V e VI forma connessioni filamentose tra il collagene interstiziale e la membrana basale epiteliale.
Lo strato intermedio (Strato spugnoso o zona spongiosa) della matrice stromale si trova adiacente alla membrana corionica; il suo abbondante contenuto di proteoglicani e glicoproteine produce un aspetto spugnoso in preparati istologici e presenta un reticolo non fibrillare essenzialmente di collagene di tipo III . Lo strato spugnoso è lassamente collegato alla membrana corionica e di conseguenza, la MA è facilmente separabile dal corion mediante dissezione. (NiKnejad 2008 )
5.2 La membrana amniotica come supporto nella ingegneria tissutale
Una componente importante dell’ ingegneria tissutale è la matrice di sostegno su cui le cellule e i tessuti possono crescere. Le matrici di sostegno devono integrarsi facilmente con il tessuto ospite e fornire un eccellente ambiente per la crescita e la differenziazione cellulare e, nella maggior parte dei casi, devono derivare da tessuti di mammiferi. La membrana amniotica (MA) è considerata matrice di sostegno ed è stata una delle prime ad essere usata a questo scopo.
Un presupposto importante per la scelta di una matrice di supporto è la sua biocompatibilità. Biocompatibilità è la proprietà di essere biologicamente compatibile ovvero di non produrre fattori cellulotossici, cancerogeni o immunologici nei tessuti viventi (Baguneid et al., 2006). La matrice che serve da impalcatura non dovrà essere distrutta da una risposta infiammatoria e dovrà per contro essere in grado di accogliere adeguatamente il tessuto ospite (Young et al., 2005). Inoltre, le proprietà meccaniche dovranno includere la permeabilità, la stabilità, la elasticità, la flessibilità, la plasticità e una velocità di riassorbimento che sia congruente con la velocità della rigenerazione cellulare (Yang et al., 2001).
La matrice dovrebbe inoltre consentire l’adesione cellulare e contenere i fattori di crescita (Walgenbach et al., 2001).
La presenza o l'assenza di alcune molecole della matrice extracellulare (ECM) come il collagene, la laminina, la fibronectina e la vitronectina all'interno di qualsiasi membrana basale, ha una enorme influenza sulla l'adesione e la crescita delle cellule staminali sovrastanti.
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Inoltre queste molecole permettono alle cellule di aderire tra di loro e di migrare, trasmettendo segnali attraverso la loro interazione a livello dei recettori della superficie cellulare.
I recettori di superficie noti come integrine sono recettori di transmembrana hanno un dominio extracellulare che si lega alla ECM e un dominio intracellulare che si lega al citoscheletro.
A sua volta, il citoscheletro è associato con le varie strutture ed enzimi intracellulari nonché con la membrana nucleare. Così le integrine regolano i processi intracellulari importanti, come endocitosi ed esocitosi, i processi di proliferazione cellulare, la differenziazione e/o apoptosi (Moiseeva, 2001; Aplin, 2003). Quindi la MA risulta essere una matrice ottimale proprio per la presenza di fattori come le citochine , molti dei quali con caratteristiche e meccanismi di azione sconosciuti ma che conferiscono ad essa potenti capacità anti infiammatorie, anti cicatriziali, anti angiogeniche.
L’azione anti infiammatoria della MA è mediata in parte dall’interleuchina 10 (IL-10) che sopprime o contrasta le azioni delle citochine IL-6 e IL-8 (chemochina capace di attirare la migrazione dei neutrofili) ed il TNF α. Inoltre la capacità inibitoria di MA è dovuta anche alla produzione di inibina ed activina che appartengono alla super famiglia di TGF-β in grado di inibire la produzione IL-6 e IL-8. La MA contiene inibitori di diverse proteasi responsabili di processi infiammatori. Queste caratteristiche della MA sono responsabili dell’azione antiinfiammatoria che si verifica conseguentemente al trapianto di questa sulla superficie oculare. La MA contiene l’antagonista del recettore IL-1 (IL-1RA). IL-1RA è un potente inibitore di IL-1 (potente citochina pro-infiammatoria) e pertanto riesce ad evitare l’infiammazione mediata da IL-1.
Uno studio fatto da Tseng et al. (2004) ha dimostrato che cellule epiteliali limbari, coltivate sulla matrice stromale MA, hanno aumentato l’espressione di IL-1RA inibendo così la produzione di IL-1 e di conseguenza diminuendo l’effetto infiammatorio di questa.
La matrice stromale della MA svolge un’azione anti-cicatriziale, in quanto inibisce l’espressione genica del fattore di crescita trasformante β (TGF-β) e del suo recettore espresso sui fibroblasti della superficie oculare inibendo l’eventuale fibrosi. Questo è importante non solo dal punto di vista patologico ma anche fisiologico perché viene mantenuto il fenotipo normale dei cheratociti corneali. I cheratociti, inclusi nella stroma corneale, sono l’unica popolazione di cellule mesenchimali derivanti dalla cresta neuronale cranica che hanno un importante ruolo nel mantenere la trasparenza corneale.
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La AM non è innervata, ma sintetizza alcuni neurotrasmettitori tra i quali il fattore di crescita nervoso (NGF). Il NGF si trova in maniera predominante nella matrice stromale ed esercita un ruolo importante nell’espansione delle culture cellulari dell’epitelio limbare. Gli effetti biologici mediati dal NGF hanno una bassa affinità per il recettore p75NTR ed un’alta affinità per il recettore trasduzionale tirosinachinasi (TrkA). Si ritiene che la segnalazione attraverso TrkA promuova la sopravvivenza cellulare mentre la segnalazione attraverso p75NTR promuova l’apoptosi e la differenzazione (Scheffer et all.2004).
E’ stato anche dimostrato che la MA è immunologicamente inerte, perché sulle cellule è espresso l’antigene di superficie HLA-G e mancano invece gli antigeni di superficie HLA di polimorfismo A-B-D ( classe I) e HLA-DR (classe II), responsabili del rigetto d’organo. L’espressione di HLA-G previene il rigetto del trofoblasto all’inizio della gravidanza (impedendo un’incompatibilità materno-fetale).
Nonostante tutti i vantaggi che ha la MA per TE, alcune insidie devono essere superate per poterla usare. La MA è un materiale biologico di origine umana e quindi è necessario mettere in atto tutte quelle precauzioni per poter prevenire la trasmissione di malattie infettive che sono sempre un rischio associato al trapianto di organi e tessuti. Le potenziali donatrici devono essere sottoposte ad uno screening efficace per eventuali fattori di rischio che potrebbero renderle inadatte per la donazione. Pertanto i test sierologici devono risultare negativi per i fattori di rischio sifilide, CMV, HIV ,epatite B, epatite C,ed altre possibili infezioni (H.Niknejad et all.2008); per HIV, HBV e HCV è obbligatoria anche la negatività ai test NAT o il retest della sierologia per questi virus dopo 180 giorni dal parto. La membrana amniotica viene separata dalla placenta raccolta subito dopo il taglio cesareo programmato in modo asettico e poi conservata a -80°C in glicerolo e terreno DMEM fino al momento dell’uso. Tale tessuto è già utilizzato in oftalmologia da molti anni proprio per le sue proprietà peculiari.
La MA, come supporto per TE, è usata senza epitelio, cioè viene denudata. Le manovre di disepitalizzazione non devono danneggiare la sottostante struttura.