Metodi farmacologici

Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate secondo le linee guida CEE 86-609 riguardanti la sperimentazione animale.

6.2.1 Protocolli vascolari in vitro

Gli effetti dei composti sono stati testati su anelli di aorta toracica di ratti maschi Wistar normotesi (250-300 g). Dopo una leggera anestesia con etere, i ratti sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale e dissanguamento.

Le aorte sono state immediatamente espiantate e private da tessuti estranei, e lo strato endoteliale è stato rimosso grattando gentilmente la superficie interna dei vasi con un ago ipodermico. Anelli di aorta larghi cinque millimetri sono stati sospesi, sotto un carico di 2g, in 20 mL di bagno contenente soluzione Tyrode (composizione salina in mM: NaCl 136.8; KCl 2.95; CaCl2 1.80; MgSO4 7H2O 1.05; NaH2PO4 0.41; NaHCO3 11.9; glucosio 5.5) termostatata a 37°C e gassata continuamente con una miscela di O2 (95%) e CO2 (5%). Le variazioni della tensione sono state registrate mediante un trasduttore isometrico (Grass FTO3) collegato con un preamplificatore (Buxco Eletronics) e con un software di acquisizione dati (BIOPAC Sytems Inc., MP 100).

Dopo un periodo di equilibrazione di 60 minuti, la rimozione dell’endotelio è stata confermata tramite la somministrazione di acetilcolina (Ach) (10 μM) ad anelli precontratti con KCl (20 mM). Un rilasciamento minore del 10% della contrazione indotta dal KCl è stato considerato indicativo di una sufficiente mancanza di strato endoteliale, mentre gli organi che hanno mostrato un rilasciamento ≥ 10% (corrispondente ad una significativa presenza di endotelio) sono stati scartati.

Da 30 a 40 minuti dopo la conferma della rimozione dell’endotelio, le preparazioni aortiche sono state contratte con una singola concentrazione di KCl (20mM), e quando la contrazione ha raggiunto una fase stabile di plateau, sono state aggiunte concentrazioni cumulative delle sostanze testate (da 10 nM a 100 μM).

Esperimenti preliminari hanno mostrato che la contrazione indotta dal KCl rimaneva stabile per almeno 40 minuti.

6.2.2 Analisi dei dati

L’efficacia vasorilasciante è stata valutata in termini di massima risposta vasorilasciante, espressa come percentuale del tono contrattile indotto da KCl 20 mM. Quando la concentrazione

della concentrazione molare dei composti testati che provoca una riduzione del 50% del tono contrattile indotto dal KCl 20mM. Il pIC50 non è stato calcolato per quei composti che hanno mostrato parametri di efficacia minori del 50%. I parametri di efficacia e potenza sono stati espressi come valore ± errore standard, per 5-10 esperimenti. I dati sperimentali sono stati analizzati mediante procedura computerizzata (software: GraphPad Prism 4.0).

6.2.3 Protocolli cardiaci in vitro

Ratti maschi adulti Wistar (260-350 g) sono stati trattati, mediante iniezione intraperitoneale (circa 0.3 ml), con una dose di 40 mg/Kg dei seguenti composti: diazossido, i composti sintetizzati, il veicolo (DMSO), o con una dose di 1 mg/Kg per quanto riguarda il cromakalim.

Dopo 2 ore, tutti gli animali sono stati anestetizzati con sodio pentobarbital (100 mg/Kg i.p.) ed eparinizzati (100 UI i.p.) per prevenire la coagulazione. Per verificare l’effettiva selettività verso i canali KATP mitocondriali, in un’altra serie di esperimenti è stato somministrato ai ratti 5-idrossi decanoato, un bloccante selettivo di questi canali, in dosi da 10 mg/Kg, 20 minuti prima della somministrazione dei composti testati.

Dopo apertura del torace, i cuori sono stati rapidamente espiantati e posti in una soluzione di Krebs a 4°C (composizione in mM: NaHCO3 25.0; NaCl 118.1; KCl 4.8; MgSO4 1.2; CaCl2 H2O 1.6; KH2PO4 1.2; glucosio 11.5) equilibrata con 95.5% di O2 e 5% di CO2, per indurre cardioplegia transitoria e ridurre il consumo di ossigeno. Rapidamente, l’aorta ascendente è stata incannulata e i cuori sono stati montati in un apparato Langendorff, quindi perfusi con la soluzione di Krebs (termostatata a 37°C e continuamente gorgogliata con 95% di O2 e 5% di CO2) a pressione costante (70-80 mmHg). Tale procedura è stata completata entro 2 minuti dall’espianto dell’organo.

Un palloncino di latex riempito di acqua e connesso ad un trasduttore di pressione (Bentley Trantec, mod 800) è stato introdotto nel ventricolo sinistro attraverso la valvola mitralica e il volume è stato aggiustato per ottenere una pressione diastolica del ventricolo sinistro di 5-10 mmHg. La frequenza cardiaca (HR) e la pressione sviluppata dal ventricolo sinistro (LVDP) sono stati monitorati da un sistema Byopac (California, USA) e il parametro di prodotto frequenza x pressione (RPP) è stato calcolato come RPP = HR x LVDP. Per evitare che una caduta fisiologica dell’attività contrattile, dovuta ad un lungo periodo di riperfusione, (che potrebbe causare un danno non esclusivamente collegato all’ischemia), potesse influenzare la corretta analisi dei dati funzionali, il valore di RPP registrato al 30° minuto di riperfusione (RPP-30’) è stato considerato più significativo di quello registrato all’ultimo minuto di riperfusione (RPP-120’).

I parametri di RPP-30’ e RPP-120’ sono stati espressi come percentuale del valore di RPP misurato all’ultimo minuto del periodo pre-ischemico.

Il flusso coronarico (CF) è stato misurato volumetricamente ed espresso come mL di perfusato raccolto in un minuto.

Dopo un periodo pre-ischemico di equilibrazione di 30 minuti, i cuori sono stati sottoposti a 30 minuti di ischemia globale. I cuori che hanno mostrato gravi aritmie o valori di HR e LVDP instabili, sono stati esclusi dall’esperimento. Al termine del periodo ischemico i cuori sono stati riperfusi per un periodo di 120 minuti. Inoltre, l’enzima lattato deidrogenasi (LDH, un marker biochimico di danno ischemico), raccolto negli ultimi 5 minuti di fase pre-ischemica e poi ogni 5 minuti durante il periodo di riperfusione, è stato misurato con un metodo spettrofotometrico. La quantità di LDH rilasciata è stata espressa in mU enzimatiche rilasciate in 120 minuti di riperfusione (applicando una correzione relativa alla quantità registrata nella fase pre-ischemica), risultante dall’analisi AUC (area sotto la curva, nel grafico cartesiano, della quantità di LDH registrata a determinati intervalli in funzione del tempo) e relativa ad 1 g di peso del cuore.

Al termine della riperfusione i cuori sono stati rimossi dall’apparato Langendorff e il ventricolo sinistro è stato tagliato in sezioni larghe 2 mm, le quali sono state prima immerse in una soluzione acquosa al 10% di 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) per 20 minuti, e poi fissate in una soluzione acquosa al 20% di formaldeide.

Dopo 24 ore le sezioni di ventricolo sono state fotografate e analizzate, allo scopo di evidenziare le aree necrotiche dovute al fenomeno ischemico (visibili in bianco o rosa chiaro) e le aree sane (visibili in rosso scuro, dovuto alla reazione del TTC), e quindi di calcolare la percentuale di area ischemica rispetto all’area cardiaca totale.

6.2.4 Protocolli in vivo

Gli effetti dei composti sulla pressione sanguigna sono stati testati su ratti maschi Wistar normotesi di 10 settimane (250 g).

Allo scopo di stabilire un omogeneità di trattamento con i protocolli cardiaci in vitro, gli animali sono stati eparinizzati (100 UI i.p.) e poi anestetizzati con sodio pentobarbital (60 mg/Kg). Dopo la somministrazione di anestetico, le code degli animali sono state esposte a 40 minuti di irraggiamento con una lampada IR per determinare una vasodilatazione; durante questo periodo i valori di pressione sistolica sono stati registrati con il metodo sfigmomanometrico del “tail-cuff”

cromakalim (1 mg/Kg).

In seguito alla somministrazione dei composti, i valori della pressione sistolica sono stati registrati per un’ora (durante questo periodo, se necessario è stata somministrata una dose di mantenimento di sodio pentobarbital di 10 mg/Kg i.p.).

6.2.5 Materiali

Le sostanze usate nei protocolli sperimentali farmacologici sono KCl (CarloErba) sciolto (2M) in una soluzione Tyrode; acetilcolina cloridrato (Sigma) sciolta (0.1 M) in etanolo 95% e ulteriormente diluita in acqua bidistillata. L’eparina Vister è stata fornita da Pfizer come preparazione iniettabile.

Tutti i composti sintetizzati sono stati disciolti in DMSO e, se necessario, ulteriormente diluiti nella soluzione Tyrode.

Tutte le soluzioni sono state preparate estemporaneamente subito prima della procedura sperimentale. Per quanto riguarda i test in vivo sul sistema vascolare, esperimenti precedenti hanno dimostrato la completa inefficacia della somministrazione del veicolo.

1.1 Topologia ... 3

1.2 Regolazione... 4

1.3 Modulazione farmacologica dei canali KATP... 5

1.4 I canali KATP nella muscolatura liscia vascolare... 9

1.5 Canali KATP della muscolatura liscia non-vascolare ... 9

1.6 Canali KATP mitocondriali... 14

Bibliografia ... 16

2. ATTIVATORI DEI CANALI KATP (KCOs) ... 17

2.1 KCOs di prima generazione... 17

2.2 KCOs di seconda generazione ... 29

Bibliografia ... 42

3. PRECONDIZIONAMENTO ISCHEMICO ... 44

3.1 Danno da ischemia-riperfusione ... 44

3.2 Il precondizionamento ischemico ... 45

3.3 Pre- e postcondizionamento cardiaco ... 45

3.4 Meccanismi cellulari del precondizionamento ... 46

3.5 Canali mitoKATP e cardioprotezione... 52

Bibliografia ... 55

4. TARGET TERAPEUTICI DEL PRECONDIZIONAMENTO... 57

4.1 Recettori dell’adenosina... 57

5.1 Scopo della tesi ... 69

5.2 Benzopirani contenenti uno spiro eterociclo a sei termini... 70

5.3 Benzopirani che presentano uno spiro-eterociclo a 5 termini... 86

Bibliografia ... 95

6. Parte sperimentale ... 96

6.1 Chimica ... 96

incoraggiata. Grazie perché mi spingi a dare sempre il meglio e credi in me più di quanto a volte non faccia io stessa.

Vorrei ringraziare il prof. Balsamo, per avermi dato la possibilità di lavorare nel suo laboratorio e di fare la bellissima esperienza del Dottorato di Ricerca.

Grazie a Simona, che mi ha insegnato moltissimo, trasmettendomi la passione per questo lavoro, e che oltre ad un “capo” è stata e sarà sempre un’amica.

Grazie a Ketty, compagna di lavoro insostituibile e amica sincera, e a Marilisa e Micheal, per aver reso ancora più allegre le giornate in laboratorio.

Ringrazio il dottor Vincenzo Calderone e le dottoresse Lara Testai e Alma Martelli per aver curato tutti gli aspetti farmacologici di questo lavoro, e per la loro simpatia.

Grazie a tutti i dottori e dottorandi: Filippo Minutolo, Simone Bertini, Elisa Ghilardi, Elisa Nuti, Michela Antonello, Irene Banti, Musa Ahmed,Valentina Asso, Isabella Carboni, Paolo Carelli, Giovanni Prota.

Infine, ringrazio la mia famiglia, senza la quale non sarei arrivata fino a qui: grazie per avermi fatto diventare la persona che sono, vi voglio bene.