La conoscenza approfondita delle basi molecolari coinvolte nello sviluppo del cancro cervicale potrebbe favorire la diagnosi e il trattamento di questo tipo di tumore e potrebbe portare allo sviluppo di nuovi trattamenti, più specifici ed efficaci, per la prevenzione della progressione della malattia e anche per l’utilizzo in terapia.
Negli ultimi anni sono stati condotti studi che utilizzavano la tecnica del microarray, con l’intenzione di identificare cambiamenti di espressione genica in cheratinociti associati ad infezioni con HPV ad alto rischio o coinvolti nel processo di carcinogenesi cervicale (Chang and Laimins, 2000; Nees et al., 2001; Oh et al., 2001; Alazawi et al., 2002; Chen et al., 2003). Alcuni studi di espressione genica relativi al cancro cervicale sono stati condotti su
biopsie tumorali congelate, oppure su cheratinociti umani transfettati in vitro con HPV o su modelli di cellule epiteliali cervicali.
3.2.1 Microarray su tessuti
Numerosi studi di microarray sono stati condotti su biopsie di tessuto. Occorre tenere presente che biopsie congelate di tessuto cervicale tumorale e normale possono contenere un numero significativo di cellule stromali contaminanti e anche cellule immunitarie derivate dall’ospite, come monociti, cellule dendritiche e linfociti che potrebbero alterare il risultato del profilo di espressione genica. Per ottenere dati affidabili, occorre analizzare popolazioni di cellule omogenee e in alcuni casi, per raggiungere un grado di omogeneità soddisfacente, si utilizza la microdissezione laser (LMD), nota anche come microscopia laser capture. Tale tecnica permette di isolare sezioni di tessuto oppure un piccolo numero di cellule da tessuti congelati o fissati in formalina o inclusi in paraffina, evitando contaminanti circostanti l’area di interesse che possono alterare i risultati sperimentali. In questo modo è quindi possibile limitare le cellule derivanti dalla parte tumorale, separandola dal tessuto normale, dalla componente stromale e da cellule del sistema immunitario.
In diversi studi di microarray sono stati confrontati il pattern di espressione genica di biopsie di carcinoma cervicale e con quello di biopsie di tessuti normali (Cheng et al., 2002; Chen et al., 2003; Wong et al., 2003; Rosty et al., 2005; Wong et al., 2006; Chao et a., 2006). In questi studi tuttavia non sono stati studiati tutti i meccanismi molecolari che portano allo sviluppo del tumore, passando attraverso i vari stadi di progressione neoplastica delle lesioni intraepiteliali cervicali CIN. Tali meccanismi sono stati invece indagati da altri ricercatori che nel loro studio, oltre a tessuto di carcinoma cervicale e tessuto normale, includono biopsie di lesioni preneoplastiche CIN (Gius et al., 2007; Arvantis and Spandidos, 2008; Song et al., 2008; Rajcumar et al., 2011). Il lavoro di Gius e colleghi è il primo lavoro a mettere in evidenza l’espressione genica nei vari gradi CIN e ad individuare marcatori della progressione neoplastica nella componente epiteliale e nella componente stromale circostante. In questo modello, il grado CIN1 è caratterizzato dall’espressione di geni proproliferativi/immunosoppressivi, dovuti probabilmente alla risposta epiteliale all’infezione ad opera del papillomavirus. La transizione verso il CIN2 coincide con l’attivazione di pathway di pro-angiogenesi nei fibroblasti e la transizione verso il CIN3 e verso il carcinoma
squamoso è caratterizzata da espressione genica proinvasiva, in un ambiente in cui i nutrienti diventano limitati (Gius et al., 2007).
3.2.2 Microarray su cheratinociti trasfettati con HPV
Linee cellulari di cheratinociti trasfettati in vitro con il genoma di HPV rappresentano un modello in grado di mimare le caratteristiche delle cellule cancerose, acquisendo la capacità di crescere autonomamente e mostrando perdita di differenziamento, overespressione del recettore per EGF, resistenza all’inibizione della crescita ad opera di TGF-beta (Pirisi et al., 1987; Pirisi et al., 1988; Zyzak et al., 1994; Creek et al., 1995; Mi et al., 2000; Borger et al., 2000; Akerman et al., 2001). (Chang and Laimins, 2000; Nees et al., 2001; Oh et al., 2001). Questo modello non rispecchia la situazione in vivo e per quanto riguarda lo studio del carcinoma cervicale non rappresenta un buon modello, poiché non studia direttamente cellule di cervice, ma cheratinociti epiteliali derivanti da altri distretti corporei successivamente trasfettati. Di conseguenza i pathway coinvolti in questo modello saranno diversi dai pathway coinvolti nello sviluppo della progressione neoplastica cervicale.
Nonostante ciò diversi ricercatori hanno continuato ad usare questo modello per cercare di individuare i processi molecolari coinvolti nella trasformazione indotta da HPV e lo sviluppo del tumore (Ruutu et al., 2002; Duffy et al., 2003 Kravchenco-Balasha et al., 2009).
3.2.3 Microarray su cellule epiteliali cervicali
In letteratura non sono presenti molti lavori che utilizzano cellule cervicali per lo studio dell’espressione genica.
Un lavoro di Nees e colleghi si basa su colture primarie di cheratinociti ectocervicali ottenute da tessuto cervicale proveniente da isterectomie e coltivate in terreno privo di siero. Le cellule da lui utilizzate sono state infettate con retrovirus che esprimevano i geni E6 ed E7 di HPV-16 (Nees et al., 2001).
In altri lavori vengono adottate linee cellulari commerciali, come la linea W12, che deriva da una naturale infezione cervicale di basso grado HSIL (Stanley et al., 1989) e rappresenta un buon modello di studio per l’investigazione della storia naturale della neoplasia cervicale. Con questo modello, nel lavoro di Alazawi e colleghi è stato studiato l’effetto
dell’integrazione episomale nell’ospite sull’espressione genica di cheratinociti cervicali positivi per HPV-16, come un componente di progressione verso la malignità (Alazawi et al., 2002). Sono stati individuati gruppi di geni che mostravano cambiamenti di espressione dovuti all’integrazione di HPV.
Anche nel lavoro di Pett e colleghi è stata usata la linea W12 come modello di carcinogenesi cervicale squamosa, dimostrando che la perdita di HPV in forma episomale è associata all’attivazione endogena di geni di risposta antivirale che sono inducibili attraverso il pathway dell’IFN di tipo I, durante l’integrazione di HPV-16 (Pett et al., 2006). Questo modello presenta comunque dei limiti, in quanto si basa soltanto sullo studio di un tipo di lesione cervicale intraepiteliale a basso grado.
Un lavoro di Santin e colleghi, a partire da tumori primari, risulta essere l’unico basato sullo studio di microarray su cellule in coltura, derivate comunque da carcinomi cervicali, ma non da lesioni preneoplastiche CIN (Santin et al., 2005). In questo lavoro lo studio del profilo di espressione genica è stato condotto su 15 linee cellulari cervicali primarie (11 colture primarie di cancro cervicale positive per HPV-16 o HPV-18 derivate da uno stadio precoce di malattia e 4 linee cellulari di cheratinociti cervicali normali).