Corrado Fagnani1, Simonetta Pulciani2, Anna Di Lonardo2
1Centro Nazionale di Epidemiologia, Sorveglianza e Promozione della Salute, Istituto Superiore di Sanità, Roma
2Centro per la Ricerca e la Valutazione dei Prodotti ImmunoBiologici, Istituto Superiore di Sanità, Roma
I gemelli come risorsa per gli studi di genetica
Gli studi sui gemelli sono stati fra i primi studi sull’ereditarietà dei caratteri umani. Nella seconda metà dell’Ottocento, Francis Galton, psicologo e naturalista inglese, intuì per primo le potenzialità di un metodo di indagine scientifica basato proprio sull’osservazione delle coppie gemellari. Galton, infatti, concepì lo studio dei gemelli come il migliore strumento per valutare gli effetti dell’ereditarietà (nature) e dell’ambiente (nurture) sulle caratteristiche umane, ovvero per effettuare una distinzione fra le tendenze ricevute alla nascita e quelle imposte da speciali circostanze della vita successiva.
I gemelli sono un’importante risorsa per l’epidemiologia genetica. In questo campo di ricerca, che si avvale di metodi e tecniche propri dell’epide-miologia classica, della biostatistica, della biologia molecolare e della genetica delle popolazioni, il metodo gemellare viene utilizzato per quantificare il ruolo delle influenze genetiche ed ambientali nel determinare la variabilità inter-individuale di tratti multifattoriali, quali la suscettibilità a malattie com-plesse, i fenotipi intermedi di tali malattie, oppure le caratteristiche fisiche e del comportamento. A differenza degli studi sulle famiglie, le indagini sui gemelli offrono il notevole vantaggio di poter direttamente stabilire se l’even-tuale aggregazione riscontrata per un certo fenotipo all’interno di nuclei familiari sia causata da fattori genetici o da esposizioni ambientali comuni ai membri delle famiglie.
Il Registro Nazionale Gemelli
L’Italia vanta una grande tradizione scientifica in materia di gemelli. Negli anni cinquanta, Luigi Gedda, con la pubblicazione del libro “Studio dei
Gemelli” (Gedda L., 1951), ha sancito la nascita della “gemellologia”. Gedda aveva intuito l’importanza di una raccolta sistematica di dati sulla popolazio-ne gemellare, tanto che fin da allora aveva dato inizio, presso l’Istituto Mendel di Roma, all’imponente arruolamento di una coorte volontaria di circa 40.000 gemelli; questa coorte, seguita fin dal 1950 per circa quaranta anni, ancora oggi costituisce una preziosa banca di informazioni per studi su caratteri complessi, benché non siano disponibili dati su indicatori molecolari.
Quello che, però, mancava in Italia era un registro di gemelli su base di popolazione, analogo a quelli istituiti in molti paesi nordeuropei. Tali registri, contenendo informazioni fenotipiche, genotipiche e sullo stile di vita di un elevato numero di gemelli e, talvolta, dei loro familiari, costituiscono una preziosa risorsa per la ricerca in epidemiologia genetica (Boomsma D. et al., 2002, Busjahn A. e Hur Y.M., 2006).
Nel 2000, l’Italia, in linea con altri stati in Europa e nel mondo, ha istitu-ito il “Registro Nazionale Gemelli” (RNG, www.gemelli.iss.it). Tale registro, tenuto presso il Reparto di Epidemiologia Genetica dell’Istituto Superiore di Sanità di Roma, ha come obiettivo principale quello di utilizzare i dati sui gemelli per investigare i fattori ereditari ed ambientali che contribuiscono all’espressione fenotipica di caratteri umani, normali e/o patologici (Stazi M.A. et al., 2002, Fagnani C. et al., 2006). Ad oggi, il RNG include informa-zioni su circa 15.000 gemelli di diverse fasce di età ed aree geografiche, ed è coinvolto in numerosi studi di epidemiologia genetica su caratteri complessi, molti dei quali condotti nell’ambito di consorzi internazionali.
Il metodo gemellare classico si basa sul confronto tra la correlazione o la concordanza osservata in gemelli monozigoti (MZ) e quella rilevata in gemelli dizigoti (DZ), per un certa caratteristica in studio. Dato che i gemelli MZ sono geneticamente identici, mentre i DZ condividono, in media, il 50% dei geni, al pari di normali fratelli, un’eventuale maggiore correlazione o concordanza osservata tra i MZ rispetto ai DZ può essere assunta come evidenza di influenze genetiche sulla caratteristica in studio, e la differenza tra le correlazioni nei MZ e nei DZ può essere usata come indice di “ereditabilità”. Il ragionamento, però, è valido solo se si assume che i gemelli MZ condividano le esperienze ambientali, rilevanti per la caratteristica in esame, nella stessa misura dei DZ [equal environments assumption (Spector T.D. et al., 2000)]. Questa costituisce l’assunzione di base del metodo gemellare, e, sebbene sia stata spesso additata come un grave punto debole del metodo, numerosi studi ne hanno dimostrato la validità per la maggior parte dei tratti di interesse in epidemiologia genetica, ed hanno verificato che eventuali violazioni portano, in genere, ad una minima sovrastima dell’ereditabilità.
I gemelli e l’epidemiologia genetica
Di recente, la definizione della sequenza del genoma umano e la progressiva identificazione delle sue varianti hanno aperto nuovi percorsi nella ricerca in epidemiologia genetica, dando ulteriore vigore anche al metodo di indagine che utilizza i gemelli.
Innanzitutto, i risultati degli studi sui gemelli possono essere considerati preliminari a studi genetici più approfonditi, volti ad individuare e localizzare le varianti geniche implicate nell’espressione fenotipica di specifici tratti. E’ chiaro, infatti, che ha senso effettuare tali studi solo nel caso di tratti per i quali vi siano consistenti evidenze, provenienti, ad esempio, da studi sui gemelli (ma non solo), a favore di un sufficiente carico di ereditabilità, ovvero a favore dell’esistenza di polimorfismi che potrebbero contribuire, in modo rilevante, alle differenze fenotipiche inter-individuali osservate.
Nel corso degli ultimi anni, i gemelli si sono anche rivelati un setting particolarmente vantaggioso in cui alcuni disegni di studio, classicamente adottati in epidemiologia genetica, sono stati applicati con straordinaria efficacia. Ad esempio, i gemelli DZ possono essere utilizzati per effettuare studi genetici cosiddetti “di linkage” tramite il metodo denominato “affected
sib pair”. L’obiettivo di questi studi è verificare se coppie di fratelli che
presentano un certo carattere in esame, eventualmente una patologia, tendono a condividere le varianti di specifici geni in misura maggiore rispetto a quanto atteso sotto l’ipotesi che non vi siano legami tra il carattere in studio e quei geni. Se si osserva un eccesso di condivisione, ciò costituisce un’evidenza che quei geni sono coinvolti (o localizzati vicino ai geni coinvolti) nell’espressione del carattere. Gli studi di linkage condotti su gemelli DZ, rispetto a quelli eseguiti su fratelli non gemelli, permettono sia di rimuovere la variabilità intra-coppia dovuta all’età, fattore fondamentale nell’insorgenza di tante patologie, sia di ridurre quella dovuta ad una serie di altri fattori, quali le esposizioni ambientali in utero e nella prima infanzia, conferendo così una maggiore potenza statistica al disegno di studio.
Per le stesse ragioni, i gemelli offrono le condizioni ideali anche per gli studi genetici “di associazione” basati sul disegno “caso-controllo”, il cui scopo è verificare se la frequenza di una variante allelica di uno specifico gene in individui affetti da una certa patologia (casi) differisce da quella osservata in individui sani (controlli). E’ evidente che, affinché l’eventuale discrepanza nella frequenza della variante tra casi e controlli possa esclusivamente attribuirsi alla presenza/assenza della patologia, casi e controlli devono essere confrontabili per una serie di fattori che potrebbero essere associati sia con la variante che con la patologia. In un simile contesto, assume rilievo il disegno di studio “case-cotwin control”, in cui i casi e i controlli sono
rappresentati, rispettivamente, da gemelli malati e dai loro co-gemelli sani. Questo disegno di studio può avvalersi sia di gemelli MZ che di gemelli DZ. Se applicato a soli gemelli MZ, esso garantisce non solo un livello ottimale di comparabilità dei due gruppi rispetto a numerosi determinanti ambientali, ma anche un appaiamento perfetto per tutte le varianti alleliche diverse da quella in esame.
I gemelli e lo studio dei meccanismi epigenetici
Oltre ad offrire evidenti vantaggi nell’utilizzo di metodi già noti in epide-miologia genetica, i gemelli hanno anche aperto la strada alla messa a punto di disegni di studio totalmente nuovi, in grado di fornire alla ricerca genetica molecolare informazioni mai prodotte in precedenza. Il disegno di studio più mirabilmente rivoluzionario, per la profondità delle sue implicazioni e la complessità delle tecniche che ad esso si sono affiancate, è senz’altro quello basato sulle coppie di gemelli MZ discordanti per una certa condizione, cioè in cui la condizione è presente in uno solo dei due gemelli. Un interrogativo che ricorre da sempre è perché i gemelli MZ, pur identici nel patrimonio genetico, possono presentare discordanze per patologie e/o altri caratteri fenotipici.
Oltre ad essere il risultato di diverse esperienze ambientali vissute dai due gemelli o di mutazioni genetiche sopraggiunte in uno solo dei gemelli dopo la nascita, tali differenze possono essere prodotte, secondo i più recenti studi, anche da “meccanismi epigenetici”. I meccanismi epigenetici sono quelle modificazioni di tipo reversibile che interessano la struttura del DNA, ma non la sua sequenza.
Il fatto che, ad esempio, una specifica malattia insorga soltanto in uno di due gemelli geneticamente identici costituisce la situazione ideale per individuare differenze nei profili di espressione genica, ed investigare il ruolo dei meccanismi epigenetici nel determinare l’insorgenza della malattia stessa. Tra le modificazioni epigenetiche meglio studiate vi sono la metilazione della citosina e l’acetilazione degli istoni (Suzuki M.M. e Bird A., 2008), che comportano una variazione nell’assetto sterico della doppia elica, favorendo o limitando la funzione degli enzimi deputati alla trascrizione del messaggio genetico. Tali fenomeni interferiscono nella struttura della cromatina, alte-rando il processo di trascrizione, prima tappa nella sintesi proteica. L’effetto finale è una variazione nel contenuto proteico, capace di generare differenti fenotipi.
Applicazioni della tecnologia dei Microarray allo studio dei gemelli
La tecnica dei Microarray risulta particolarmente versatile negli studi in cui vengono impiegati i gemelli MZ discordanti sia per determinare le alterazioni epigenetiche che per analizzare le variazioni nell’espressione genica a queste correlate (Pulciani S. et al 2006).
Diverse sono le pubblicazioni scientifiche sulle applicazioni dei Microarray nello studio dei gemelli MZ discordanti, e, nella presente monografia, illustreremo soltanto alcune delle più recenti.
Tra le patologie più studiate usando la combinazione gemelli-Microarray, quelle neurologiche e psichiatriche sono le più frequenti.
Come primo esempio, presentiamo il caso della paralisi cerebrale. Questa è una patologia cronica che si manifesta nei primi anni di vita e comporta un aberrante controllo dei movimenti e della postura, nonché altri innumerevoli sintomi. Ne esistono diverse forme, la forma spastica, atassica, ipotonica, etc. L’eziologia di questa malattia non è stata ancora ben definita; presumibil-mente è di tipo multifattoriale, e i fattori di rischio possono agire sia durante la vita intrauterina che durante il periodo neonatale. Tra i fattori di rischio sembrano essere inclusi anche i processi infettivi, l’esposizione a sostanze teratogene, la ridotta crescita nel periodo di vita intrauterina e lo scarso peso alla nascita. Si stima che nell’1%-2% dei casi le forme di paralisi cerebrale abbiano una origine genetica. Alcuni studi condotti da McHale e collaboratori indicano in una modificazione nel cromosoma 2 la causa genetica della para-lisi cerebrale di tipo spastico ed in un’alterazione nel cromosoma 9 la causa della paralisi atassica (McHale D.P. et al., 2000).
Un gruppo di ricercatori cinesi ha impiegato i gemelli MZ come modello di studio per determinare le alterazioni genetiche responsabili della paralisi cerebrale mediante la tecnica dei DNA-Microarray (Zhang T. et al., 2007). Gli RNA totali estratti dai campioni ematici di una coppia di sorelle gemelle MZ discordanti per la paralisi cerebrale sono stati analizzati per valutare i livelli di espressione di 20.000 geni umani. I risultati ottenuti sono stati posti a con-fronto con i dati di quattro banche biologiche (FatiGO, FatiGO PLUS, KEGG, SOURCE), mettendo in evidenza nella gemella affetta da paralisi cerebrale una espressione differenziale di 2703 geni complessivamente. Per 1272 geni i livelli di espressione risultano aumentati, mentre per 1431 risultano diminui-ti. Le funzioni di molti di questi geni sono sconosciute. Bisogna precisare che la significatività statistica è stata evidenziata solo per alcuni geni coinvolti nella via biosintetica (pathway) correlata alla formazione delle giunzioni cellu-lari e per geni coinvolti nel metabolismo e nella polimerizzazione dell’actina (Zhang T. et al., 2007). Questi risultati sono estremamente interessanti poiché i
geni in questione potrebbero essere implicati nel controllo delle attività moto-rie. Pertanto, tali studi forniscono preziose indicazioni sui geni da analizzare in dettaglio per definire la base ereditaria della paralisi cerebrale.
Un’altra patologia neurologica che è stata indagata a livello molecolare utilizzando la tecnologia dei Microarray è l’epilessia con assenza, detta anche “piccolo male”, in quanto caratterizzata dalla perdita di coscienza e mancanza di convulsioni (Helbig I. et al., 2008).
Il gruppo di ricerca australiano del Dottor Helbig ha effettuato uno stu-dio trifasico sugli RNA estratti da linee cellulari linfoblastoidi derivate dai seguenti gruppi di gemelli:
cinque coppie di gemelli MZ discordanti per la patologia; a)
quattro coppie di gemelli concordanti per la patologia; b)
cinque coppie di gemelli MZ sani utilizzati come controllo. c)
Lo studio, effettuato con la tecnica del DNA-Microarray, si è articolato in tre disegni sperimentali in cui sono stati posti a confronto:
i gemelli discordanti per patologia nell’ambito della stessa coppia; a)
i gemelli concordanti per patologia con i gemelli sani; b)
i gemelli affetti dalla patologia con i gemelli sani, indipendentemente c)
dal gruppo di appartenenza (concordanti o discordanti).
I risultati ottenuti dai tre gruppi sperimentali sono stati intersecati per individuare quei geni differenzialmente espressi negli individui affetti dalla patologia rispetto a quelli espressi negli individui sani, presumibilmente correlati con l’esordio e la progressione della patologia. Questa analisi ha permesso di evidenziare una comunanza, nei soggetti malati dei tre gruppi, dell’espressione differenziale di sessantacinque geni. Tra questi, sono stati selezionati sedici geni preferenzialmente espressi nel tessuto cerebrale. Ad ulteriore conferma delle variazioni nell’espressione genica ottenute negli esperimenti di DNA-Microarray, questi sedici geni sono stati analizzati con la tecnica della Real Time PCR (RT-PCR). Gli esperimenti di RT-PCR hanno confermato che 9 dei 16 geni erano effettivamente sovraespressi nei soggetti malati. Tra questi 9 geni, assume particolare rilevanza l’alterata espressione del gene EGR1, acronimo per Early Growth Response 1, un gene implicato nella plasticità neuronale. Esso è sovraespresso anche in modelli sperimentali animali per l’epilessia così come nei foci neocorticali epilettici. Ad oggi, le vie biosintetiche correlate al gene EGR1 non sono ancora ben conosciute, anche se è stato ipotizzato che il gene EGR1 interagisca con geni implicati nella fun-zione e formafun-zione delle sinapsi (Helbig et al., 2008).
Come esempi di patologie psichiatriche presentiamo gli studi del gruppo di ricerca del Dottor Kakiuchi, rivolti a determinare i fondamenti genetici associati ai disturbi bipolari e alla schizofrenia.
A questo proposito, è stata analizzata l’espressione genica differenziale in cellule linfoblastoidi provenienti da due coppie di gemelli MZ discordanti
per disturbi bipolari ed una coppia di gemelli sani. I risultati hanno eviden-ziato nei soggetti malati una ridotta espressione nei geni XBP1 e HSPA5, connessi al metabolismo del reticolo endoplasmatico. Questo dato è una conferma dell’importanza del gene HSPA5 nella manifestazione del disturbo bipolare. Infatti, studi in vitro avevano già dimostrato che il composto chimico valproato, utilizzato come stabilizzatore dell’umore, induce l’espressione del gene HSPA5, sotto il controllo del gene XBP1. Inoltre, il gene HSPA5 risiede in posizione 22q12, ossia su un sito del cromosoma 22 già precedentemente correlato con le malattie di tipo bipolare (Kakiuchi C. et al., 2003).
Questo stesso modello sperimentale è stato applicato allo studio della schizofrenia (Kakiuchi C. et al., 2008).
È ben noto che nella schizofrenia sono coinvolti fattori genetici, come dimostrato dalla familiarità e dalla maggiore concordanza della malattia nei gemelli MZ rispetto ai gemelli DZ. Approcci sperimentali tradizionali hanno indicato come possibili cause genetiche della patologia la delezione al locus 22q11, e mutazioni nei geni DTNBP1 e NRG1, rispettivamente implicati nel legame con la distrofina e nello sviluppo del sistema nervoso.
I livelli di espressione genica sono stati analizzati in cellule linfoblastoi-di provenienti da due coppie linfoblastoi-di gemelli MZ linfoblastoi-discordanti per la schizofrenia mediante la tecnica dei DNA-Microarray, utilizzando piattaforme della ditta
Affymetrix (tipo HU133A). Questa analisi ha dimostrato che nelle cellule
lin-foblastoidi isolate dai gemelli schizofrenici vi è una maggiore espressione dei geni ADM e SEPX1.
Uno dei più recenti sviluppi della tecnologia dei Microarray è la prepara-zione di vetrini atti a rilevare modificazioni epigenetiche. Per gli aspetti tec-nici dei vetrini Microarray elaborati per l’analisi delle mutazioni epigenetiche, rinviamo alla letteratura scientifica (Suzuki M.M. e Bird A., 2008, Schumacher A. e Petronis A., 2006).
Recentemente, Kaminsky e collaboratori hanno utilizzato questo approc-cio sperimentale per rilevare le differenze nella metilazione del DNA in una coppia di gemelle MZ di 49 anni, discordanti nelle attitudini comportamentali (Kaminsky Z. et al., 2008). Questa coppia è stata prescelta in quanto le gemelle differivano palesemente sulle scelte personali e lavorative, a dispetto di un forte coinvolgimento emotivo tra di loro. La prima gemella ha intrapreso la carriera di giornalista, come corrispondente di guerra, mettendo a rischio la propria vita; si è sposata non giovanissima con un suo collega e non ha avuto figli. La seconda gemella ha intrapreso un tipo di vita ordinario, sposandosi giovane ed avendo subito due figli, e lavorando per uno studio legale part-time. Entrambe le gemelle sono state sottoposte a test psicometrici, genetici ed epigenetici. I test attitudinali hanno evidenziato nella seconda gemella un grado maggiore di ansia e tensione. Nessuna delle due gemelle era comunque affetta da disturbi psichiatrici, e la monozigosità delle gemelle è stata
confer-mata da test genetici. Infine, il DNA isolato dalle cellule nucleate del sangue delle due gemelle è stato analizzato per determinarne le differenze a livello epigenetico. Gli esperimenti effettuati hanno dimostrato un’eguaglianza delle due gemelle dal punto di vista genetico, ma non da quello epigenetico. Senza descrivere nel dettaglio gli esperimenti effettuati, ci limitiamo a sottolineare che i risultati ottenuti hanno evidenziato alterazioni nel locus 2q31.1, corri-spondente alla porzione 3’LTR del gene DLX1 (Distal–lesshomeobox1). Studi su modelli sperimentali murini hanno dimostrato che l’espressione del gene DLX1 è determinante per l’espressione dell’ormone NPY e che tale ormone è strettamente correlato con l’induzione di stati ansiosi. Ulteriori esperimenti sono necessari per determinare come la variazione epigenetica individuata possa influire sull’espressione genica e di conseguenza sul carattere delle due gemelle.
Gli studi fino ad oggi effettuati utilizzando i gemelli e la tecnologia dei
Microarray sottolineano la validità di tale modello sperimentale. Ci si auspica
che nel prossimo futuro questo approccio, coadiuvato dagli studi di genetica, possa fornire maggiori informazioni sui meccanismi molecolari di patologie complesse, che possano condurre ad una migliore diagnosi e valutazione degli approcci terapeutici.
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