Modeling degli animali transgenic

I topi Pax8.rtTA;TetO.Cre;R26.NICD1.GFP (Pax8/NICD1) e

Pax8.rtTA;TetO.Cre;R26.Confetti (Pax8/Confetti) sono stati sviluppati nel background C57Bl/6 dall’incrocio di un topo Pax8.rtTA (B6.Cg-Tg(Pax8- rtTA2S*M2)1Koes/J) con il ceppo TetO.Cre B6.Cg-Tg(TetO-Cre)1Jaw/J entrambi acquistati dalla Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). I topi doppio-transgenici sono stati quindi incrociati con il ceppo NICD1 Gt(ROSA)26Sortm1 (Notch1) Dam / J o con il ceppo Confetti Gt (ROSA) 26Sor tm1 (CAG-Brainbow2.1) Cle / J (entrambi dalla Jackson Laboratory), per ottenere un modello di topo inducibile triplo transgenico (Figura 7A). I topi Pax8/NICD1 sono stati ulteriormente incrociati con topi Pax8/Confetti per ottenere un modello di topo inducibile quadruplo transgenico (Pax8/NICD1/Confetti) (Figura 8). Da notare che i topi Pax8/NICD1/Confetti possono essere solo emizigoti per i transgeni NICD1 e Confetti, poiché entrambi sono stati inseriti nel locus ROSA26. I topi sono stati genotipizzati come riportato di seguito.

Figura 8. Schema del topo quadruplo transgenico Pax8.rtTA;TetO.Cre;R26.NICD1.GFP;R26.Confetti

(Pax8/NICD1/Confetti).

I topi Pax2.rtTA; TetO.Cre; R26.NICD1.GFP (Pax2/NICD1) e Pax2.rtTA; TetO.Cre; R26.Confetti (Pax2/Confetti) sono stati sviluppati nel background C57Bl/6 incrociando un topo Pax2.rtTA (159) (gentile donazione del Dr. Beat Schäfer, Dipartimento di oncologia e centro di ricerca per bambini, ospedale pediatrico universitario, Zurigo, Svizzera) con il ceppo TetO.Cre. I topi doppio-transgenici sono stati quindi incrociati con il ceppo NICD1 o con il ceppo Confetti, per ottenere un modello di topo triplo transgenico inducibile Pax2/NICD1 o Pax2/Confetti. I topi

37 Pax2/NICD1 sono stati ulteriormente incrociati con topi Pax2/Confetti per ottenere un modello di topo inducibile quadruplo transgenico (Pax2/NICD1/Confetti) (Figura 9). Di nota, i topi Pax2/NICD1/Confetti possono essere solo emizigoti per i transgeni NICD1 e Confetti, poiché entrambi sono stati inseriti nel locus ROSA26. I topi sono stati genotipizzati come riportato di seguito.

Figura 9. Schema del topo quadruplo transgenico Pax2.rtTA;TetO.Cre;R26.NICD1.GFP;R26.Confetti

(Pax2/NICD1/Confetti).

La ricombinazione genica del reporter è stata indotta a 5 settimane di età mediante somministrazione di 2 mg/ml (per i topi Pax8) o 4 mg/ml (per i topi Pax2) di doxiciclina iclato (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) preparata in acqua da bere con aggiunta di saccarosio al 2,5% (Sigma-Aldrich) per 10 giorni, seguiti da una settimana di washout (Figura 10).

Figura 10. Schema di induzione e attivazione del transgene nel modello murino mediante

somministrazione di doxiciclina iclato.

L'induzione degli animali che possiedono il transgene NICD1 porta all'espressione di una porzione intracellulare del gene Notch1 del topo (NICD1), ma priva del dominio PEST al C-terminale, e di una proteina verde fluorescente (Green Fluorescent Protein, GFP), la cui espressione è localizzata a livello del nucleo. L'espressione della

38 GFP non può essere rilevata mediante microscopia confocale senza colorazione con un anticorpo anti-GFP. Il frammento citoplasmatico troncato codificato dalla sequenza Notch1 causa una segnalazione costitutiva. Al fine di verificare l'effettiva attivazione dei transgeni e la successiva espressione delle proteine NICD1 e GFP, abbiamo colorato sezioni di rene di topi Pax8/NICD1 o Pax2/NICD1 con un anticorpo anti-GFP (Figura 11A). Nei topi Pax8/NICD1, abbiamo osservato che le TEC esprimevano alti livelli di GFP, mentre le cellule interstiziali rimanevano negative (Figura 11A). Nei topi Pax2/NICD1 abbiamo osservato cellule positive nella capsula di Bowman e disperse nei tubuli, coerentemente con la loro distribuzione cellulare (157) (Figura 11B).

Figura 11. Immagine confocale rappresentativa della colorazione GFP (verde). (A) Una sezione

renale di topo Pax8 / NICD1 indotto (n=4). DAPI (bianco) controcolora i nuclei. Falloidina (rosso) colora l’actina filamentosa. Bar = 25 μm. (A’) Dettaglio di A. (B) Una sezione renale di topo Pax2 / NICD1 indotto (n=6). Falloidina (rosso) colora l'actina filamentosa (F-actina). DAPI (bianco) controcolora i nuclei. La freccia (rosa) indica le RPC GFP + Pax2 +. Bar = 25 μm. (B') Dettaglio di (B).

Il reporter Confetti, in seguito all'induzione, ha permesso la marcatura stocastica delle cellule mediante ricombinazione permanente di un singolo gene codificante un colore (proteine fluorescenti rosse, gialle, verdi o blu, RFP, YFP, GFP o CFP), con

39 cellule GFP presenti ad una frequenza più bassa rispetto agli altri colori ed estremamente rare (159,181). Questa tecnica ci ha permesso di valutare la composizione clonale delle lesioni, dal momento che tutte le cellule marcate passeranno la loro proteina fluorescente alla loro progenie (159).

Dopo l'induzione, i topi sono stati lasciati invecchiare e sono stati sacrificati a 4, 12, 24 e 36 settimane dalla fine del periodo di washout (n = 4 per i topi Pax8/NICD1 e Pax8/NICD1/Confetti sacrificati a 4 settimane, n = 10 a 12 settimane, n = 8 a 24 settimane, n = 15 a 36 settimane, n = 4 per Pax8/Confetti e n = 6 Pax8/NICD1/Confetti sacrificati a 36 settimane). Gli animali Pax8/NICD1 non indotti sono stati usati come controllo e sono stati sacrificati a 36 settimane. Essi non hanno mostrato né perdita di espressione né un’espressione aspecifica del transgene (n = 10).

I topi indotti Pax2 / NICD1 di controllo non trattati sono stati sacrificati 4 settimane dopo la fine del periodo di induzione (n = 6).

Ulteriori topi sono stati indotti con doxiciclina per 10 giorni, mantenuti in un periodo di washout di 1 settimana prima di subire un danno da ischemia/riperfusione (IRI) e sono stati sacrificati 28 giorni dopo (n = 9 per i Pax8/NICD1 non indotti, n = 11 per i Pax8/NICD1, n = 4 per Pax8/Confetti, n = 5 per i Pax8/NICD1/Confetti, n = 4 per i Pax2/Confetti, n = 7 per i Pax2/NICD1, n = 4 per i Pax2/NICD1 non indotti, e n = 5 per i Pax2/NICD1/Confetti).

Non è stata osservata alcuna differenza di genere nell'estensione dello sviluppo del tumore, quindi maschi e femmine sono stati raggruppati per l'analisi. Tuttavia, poiché i topi femmina tollerano molto di più l'IRI rispetto ai maschi, solo i maschi sono stati utilizzati per gli esperimenti di IRI.

3.2 Genotipizzazione

Biopsie di coda sono state incubate per una notte a 55 ° C nel reagente di lisi (1M TrisHCl pH 8,5, 0,5 M EDTA, 20% SDS, 4 M NaCl, 0,1 mg/ml proteinasi K neutralizzato con TrisHCl 40 mM, tutto da Sigma-Aldrich), centrifugato e il DNA è

40 stato estratto usando isopropanolo (Sigma-Aldrich). I primer e i parametri di PCR per il relativo ceppo acquistato sono stati ottenuti dal sito internet della Jackson Laboratory. Per distinguere la presenza dei transgeni Pax2.rtTA, Pax8.rtTA e TetO.Cre in omo- o in eterozigosi sono state eseguite analisi di qRT-PCR utilizzando 5 ng / ml di DNA genomico con il Master LightCycler® 480 SYBR Green I (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Svizzera). Le reazioni sono state eseguite utilizzando un LightCycler® 480 (Roche Diagnostics) con un programma costituito da 40 cicli, ciascuno costituito da una fase di inizio a 95 °C per 15 ", fase di annealing a 60 °C per 45" e fase di amplificazione a 72 °C per 60 ''. Sono stati utilizzati i seguenti

primer:

Pax2.rtTA e Pax8.rtTA forward 5'-AACGCACTGTACGCTCTGTC-3 'e reverse 5'- GAATCGGTGGTAGGTGTCTC-3'; TetO.Cre forward 5'-TCGCTGCATTACCGGTCGATGC-3 'e reverse 5'-CCATGAGTGAACGAACCTGGTCG-3'. Il DNA genomico per TCRα è stato utilizzato come gene housekeeping per la quantificazione relativa ed è stato amplificato utilizzando i primer forward 5'-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3 e reverse 5'-GTCAGTCGAGTGCACAGTTT-3.