6. MODELLI ANIMALI
6.2 MODELLI MURINI
Sono stati utilizzati diversi approcci per creare modelli murini transgenici che riproducessero la patologia umana: l’espressione di tau umana wild-type o mutata, l’aumentata regolazione di una chinasi o la diminuita regolazione di una fosfatasi (Tabella 1).
Il primo modello di topo transgenico per tau esprimeva l’isoforma umana wild-type più lunga (2N4R) sotto il controllo del promotore umano neurone-specifico Thy1 (Götz et al., 1995). Si osservava la formazione di pre-filamenti, l’iperfosforilazione di tau, ma non lesioni neuropatologiche. La sostituzione del promotore umano con quello murino (Thy1.2) ha portato alla comparsa di degenerazione assonale, ma non di grovigli neurofibrillari (Probst et al., 2000).
Un grosso aumento dell’espressione del transgene si è ottenuto grazie all’utilizzo del promotore murino PrP, che ha permesso un incremento dell’espressione della proteina tau di circa 10 volte con la formazione di inclusioni simili agli NFT nei neuroni corticali e nel tronco encefalico, correlate a degenerazione e riduzione del trasporto assonale, gliosi e debolezza (Ishihara et al., 1999).
Successivamente è stato creato un modello (JNPL3) che esprimeva la proteina tau mutata P301L e che, per la prima volta, riproduceva la formazione e l’aggregazione dei grovigli neurofibrillari a livello del tronco encefalico, del diencefalo, ma
soprattutto del midollo spinale, con una perdita di circa il 50% dei neuroni e conseguente disfunzione motoria (Lewis et al., 2000). Gli animali mostravano, inoltre, gliosi, degenerazione assonale e deficit comportamentali. Questo è tuttora, il modello più utilizzato per lo studio dei meccanismi associati alla patologia tau.
In uno studio molto interessante è stato utilizzato questo modello con un vettore inducibile, che dava la possibilità di sopprimere l’espressione del transgene P301L con l’aggiunta di doxiciclina. La soppressione del transgene ha portato ad un ripristino delle funzioni mnemoniche e ad una stabilizzazione del numero di neuroni, nonostante il continuo accumulo dei grovigli neurofibrillari (Santacruz et al., 2005). Questo suggerisce che sia la tau solubile ad essere neurotossica e non gli NFT, che da soli non sono sufficienti a causare il declino cognitivo e la morte neuronale.
La perdita neuronale è maggiore in topi che esprimono la mutazione P301S rispetto alla P301L, in accordo con l’insorgenza precoce della patologia nei pazienti con questa mutazione (Allen et al., 2002). Filamenti sono stati trovati anche in topi transgenici che esprimono le mutazioni R406W (Tatebayashi et al., 2002) e V337M (Tanemura et al., 2001).
Uno studio recente ha fatto emergere un interessante e nuovo aspetto di tau: la sua trasmissione, secrezione e diffusione (Clavaguera et al., 2009). Infatti, l’estratto cerebrale derivato da topi P301S ed iniettato in topi ALZ17 (che esprimono la tau WT e che, di conseguenza, non sviluppano NFT) induce la formazione di NFT che non rimangono confinati al solo sito di iniezione. Sembra quindi che ci sia un’induzione della patologia, di cui sarebbe responsabile la tau insolubile. La teoria è supportata da uno studio simile che mostra come gli aggregati tau possano trasmettere lo stato fibrillare/non correttamente ripiegato dall’esterno all’interno delle cellule, in modo simile ai prioni (Frost et al., 2009).
I pazienti con FTD manifestano la presenza di inclusioni tau sia negli oligodendrociti che negli astrociti. Per questo alcuni studi hanno cercato di riprodurre questa caratteristica in vivo attraverso l’espressione di tau umana P301L e WT sotto il controllo dei promotori della 2',3'- ciclic nucleotide 3'-fosfodiesterasi (Higuchi et al., 2005) e della proteina acida fibrillare della glia (GFAP; Forman et al., 2005) rispettivamente. Entrambe le linee presentano disfunzioni neuronali e degenerazione assonale, mostrando che la patologia gliale colpisce anche i neuroni.
Un altro approccio per generare modelli animali di taupatie è quello di esprimere maggiormente le chinasi responsabili dell’iperfosforilazione di tau. Le prime linee di animali transgenici per GSK-3β avevano un bassissimo livello di espressione della proteina umana e, di conseguenza, di fosforilazione di tau. L’espressione della forma mutata (S9A) che rende GSK-3β sempre attiva (non viene inibita dalla fosforilazione) sotto il promotore Thy ha portato ad un aumento della fosforilazione solo nei topi più vecchi (Spittaels et al., 1998). L’utilizzo di un sistema condizionale sotto il controllo del promotore della CaM chinasi II ha portato ad un aumento della fosforilazione e a difetti di apprendimento spaziale (Lucas et al., 2001). Questi risultati fanno supporre che il solo aumento di GSK-3β non sia sufficiente per indurre neurodegenerazione. Al contrario, la creazione di un modello transgenico che esprimeva la fosfatasi PP2A mutata nella subunità catalitica Cα, quindi inattiva, ha portato ad un fenotipo pre-NFT con un aumento della fosforilazione della tau endogena murina (Kins et al., 2001). Questo dimostra il ruolo cruciale di PP2A nella fosforilazione di tau.
Linea Promotore Gene Fenotipo Autore
ALZ7 hThy1 WT htau40 T Götz, 1995 ALZ17 mThy1.2 WT htau40 T, M Probst, 2000 Tg lines 7 and
43 mPrP WT htau44 (NFT) T, M, Ishihara, 1999 JNPL3 mPrP P301L htau43 T, NFT, M, † Lewis, 2000
pR5 mThy1.2 P301L htau40 T, NFT, MEM Götz, 2001 Tg214 PDGF V337M htau40 (myc/FLAG-tagged) T, NFT, MEM Tanemura, 2001 R406W Tg CaMKII (myc/FLAG-R406W tagged) T, NFT, MEM Tatebayashi, 2002 rTg4510
(inducible) CaMKII-driven rTA+tetOp P301L htau43 NL, MEM T, NFT, Santacruz, 2005 Tau-P301L mThy1.2 P301L htau40 T, NFT,
(M), † Terwel, 2005 Tau-4R/2N mThy1.2 WT htau40 T, M Spittaels, 1999
T-279 MAPT N279K htau40 (NFT), T, M, NL Dawson, 2007 (Line 12) PL Tg 2’,3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase P301L htau34 (or WT htau34) T, GFT, M Higuchi, 2005 GFAP/tau Tg GFAP WT htau34 T, GFT Forman, 2005 P301S tau mThy1.2 P301S htau43 T, NFT, M, NL Allen, 2002
PS19 mPrP P301S htau34 M, NL, † T, NFT, Yoshiyama, 2007 Tet/GSK-3β
(inducible) CaMKII-driven rTA+tetOp GSK-3β T, MEM Lucas, 2001
GSK-3β (S9A) mThy1.2 GSK-3β (S9A) T Spittaels, 2000 Dom1 mThy1.2 PP2A Cα
L199P (dn) T Kins, 2001
Tabella 1: Principali modelli murini transgenici. Legenda: †, morte prematura; dn, mutazione dominante negativa; GFT, formazione di filamenti nella glia; h, isoforma umana; M, fenotipo motorio; MEM, decadimento della memoria; NFT, formazione dei grovigli neurofibrillari; NL, perdita neuronale; T, formazione di tau.
Lo scopo principale di questo lavoro è stato quello di studiare il ruolo della proteina tau nella stabilità cromosomica, suggerito dalla sua interazione sia con i microtubuli che con la cromatina, attraverso l'analisi citogenetica di cellule di topi transgenici che esprimono la proteina tau umana mutata e wild-type e di topi controllo. L'analisi è stata condotta su linfociti splenici e fibroblasti, come fonte di cellule non neurali, e su cellule derivate dalla zona sottoventricolare del sistema nervoso centrale.
In letteratura è stato riportato che cellule somatiche di pazienti affetti da demenza frontotemporale causata dalla mutazione P301L mostrano aberrazioni cromosomiche numeriche e strutturali, oltre ad anomalie cromatiniche e difetti del fuso mitotico (Rossi et al., 2008). Queste rotture cromosomiche potrebbero essere dovute alla fragilità della struttura cromatinica. La mutazione P301L rende tau un substrato più favorevole per l’iperfosforilazione che può diminuire il legame della proteina ai microtubuli e produrre un fuso instabile che potrebbe spiegare l’errata segregazione cromosomica.
L’utilizzo di un modello animale ha dato la possibilità di confrontare i risultati con quelli ottenuti nell’uomo per migliorare la conoscenza della funzione della proteina e per studiarne il comportamento anche nel sistema nervoso centrale, sede principale della patologia.