Modello molecolare della regolazione genica dipendente dalla densità cellulare

L’organizzazione e la funzione dei geni lux conducono a un modello semplice di regolazione. Un aspetto centrale è dato dalla permeabilità di membrana della molecola segnale HSL (Kaplan and Greenberg, 1985). Appena la concentrazione cellulare di V.

fischeri aumenta, la concentrazione di HSL gradualmente aumenta nel mezzo e nelle

cellule. La sintesi de novo di HSL risulta dalla presenza di LuxI prodotta per un livello basale di espressione. Quando la concentrazione della HSL supera la concentrazione limite per il legame con LuxR, il complesso LuxR-HSL può interagire con l’RNA polimerasi, facilitando la sua interazione con il promotore PluxI ( Stevens and Greenberg, 1997).

L’attivazione dell’operone conduce a un aumento autocatalitico nella sintesi della molecola segnale, poiché LuxI fa parte dell’operone indotto. Ciò conduce a un rapido aumento della concentrazione della HSL e dell’espressione dell’operone stesso (Eberhard et al.,1991).

Per quanto riguarda la regolazione di LuxR invece, il promotore di luxR è attivato dal recettore per l’AMP ciclico (CRP). Inoltre, alti livelli di HSL e LuxR possono reprimere l’espressione di luxR sia con meccanismi trascrizionali che post-trascrizionali (Shadel and Baldwin, 1991; 1992).

V. fischeri ha due sistemi di QS basati su HSL che lavorano in modo sequenziale (fig. 1-

6). Oltre al sistema LuxR-LuxI ha, infatti, anche il sistema AinS, (Lupp et al., 2003;Gilson et al., 1995; Visik, 2005). AinS produce l’ottanoil omoserina lattone (C8-HSL) che ad una concentrazione critica interagisce con il recettore AinR per indurre una cascata di segnali. Il

aumentare l’espressione di molti geni, tra cui dello stesso luxR (Siegl 2004). LuxR può interagire con C8-HSL per indurre debolmente la trascrizione dell’operone lux, stimolando il QS del sistema luxR-luxI.

La natura sequenziale dei due sistemi dà a V. fischeri la capacità di distinguere e rispondere a tre diverse condizioni di popolazione: una a bassa densità cellulare, quando non è percepito nessun autoinduttore; una situazione intermedia di densità cellulare, in cui C8-HSL regola un set specifico di geni; una condizione di alta densità cellulare, in cui sia C8-HSL che 3OC6-HSL inducono una risposta. Un tale arrangiamento sequenziale porta a un controllo temporale sull’espressione di vari geni (Antunes, 2007).

Figure 1-6 Sistema di regolazione della bioluminescenza in V. fischeri, includente i sistemi lux e ain (da Kuttler ed Hense, 2007

1.3.3.1

LuxR

Sono stati effettuati numerosi studi con forme mutate di LuxR di V. fischeri o di altre proteine appartenenti alla famiglia LuxR. Inoltre è stata risolta la struttura tridimensionale dell’omologo di LuxR, TraR di Agrobacterium tumefaciens, in complesso con la rispettiva HSL, la N-3-ossoottanoil-L-omoserine lattone e la sequenza di DNA (Vannini et al., 2002; Zhang et al.,2002; Chai & Winans, 2004; Choi & Greenberg, 1991; Hanzelka & Greenberg, 1995; Kiratisin et al., 2002; Lamb et al., 2003; Luo et al., 2003a; Shadel et al., 1990; Slock et al., 1990) (fig. 1-7)

I vari studi hanno portato all’assunzione che LuxR (250 amminoacidi) è costituita da due domini polipeptidici (Stevens and Greenberg, 1999) (fig.6).

Figure 1-7 Domini funzionali di LuxR.

Il dominio N terminale (NTD) della proteina, apparentemente associato anche con la membrana cellulare, è coinvolto nel legame con l’autoinduttore. In assenza di autoinduttore, blocca l’attività del dominio C terminale (CTD) che invece è coinvolto nel legame con il DNA. LuxR dovrebbe essere attivo in forma multimerica, probbabilmente in

Il dominio CTD ha un’elevata similarità con i domini elica-giro-elica (HTH) della superfamiglia di fattori trascrizionali LuxR-FixJ (Choi and Greenberg, 1992a; Fuqua et al., 1994; Egland and Greenberg, 2001). La possibilità di trasformare LuxR in un repressore, tramite la delezione del NTD, indica la sua capacità di legare in modo forte e specifico il luxbox (Egland & Greenberg, 2000). La mutagenesi di alcuni residui amminoacidici nella regione 190-224, identificata come regione putativa HTH, risulta in mutanti incapaci di legare il lux-box in un promotore artificiale lacZ (Egland and Greenberg, 2001).

Non è noto se questa regione è coinvolta nel legame specifico al DNA poiché la forma attiva full length non è stata purificata al fine di esperimenti di legame specifico in

vitro .

Egland e Greenberg (2001) hanno identificato due varianti di luxR, W201A e I206A, che possono legare il DNA del luxbox, ma incapaci di attivare la trascrizione dell’operone lux. Siccome non sono stati ottenuti varianti dello stesso tipo per mutazioni a valle del residuo 206, si ritiene che la “regione attivatrice”è poco a monte del motivo HTH. LuxR∆N purificato funziona in vitro come attivatore del promotore dell’operone lux, indipendente dalla molecola segnale (Choi & Greenberg, 1991; Stevens et al., 1994). È in Figure 1-7 TraR di Agrobacterium tumefaciens.

TraR è un omologo di LuxR. Il suo folding è descritto come come una farfalla con le ali dietro la schiena.

polimerasi di E: coli (Stevens et al., 1994). Quindi non è possibile concludere se LuxR∆N lega il DNA direttamente.

Un’ipotesi alternativa per il funzionamento della regolazione si basa sull’assunzione che il complesso LuxR-HSL potrebbe funzionare rilasciando la repressione dell’operone lux.

La sintesi di LuxR in forma attiva e il legame dello stesso LuxR alla HSL è migliorata da GroEL, indicando che l’attività delle sciaperonine è importante per stabilizzare la proteina (Hanzelka and Greenberg, 1995).

1.3.3.2

LuxI e HSL

Il primo gene dell’operone lux è luxI che dirige la sintesi di una proteina di 25kDa che in

E. coli è necessaria e sufficiente per produrre

l’autoinduttore 3O-C6-HSL di V. fischeri (Kuo et al., 1996).

Sono state identificate in diversi batteri molte HSL sintasi con un elevato grado di similarità (25-35% di identità) con LuxI (Lewenza et

al.,1999).

Analisi mutazionali definiscono due regioni importanti per la sua attività come HSL sintasi: la regione che comprende i residui amminoacidici 25-70 dovrebbe costituire il sito attivo dell’enzima; la regione 104-164 coinvolta nel riconoscimento specifico del substrato. Quest’ultima regione contiene dei Figure 1-8 Sintesi del 3OC6-HSL da

parte di LuxI. I substarti utilizzati sono normalmente presenti nella cellula poiché derivano da altre vie metaboliche fondamentali. Il 3OC6-ACP è un intermedio della sintesi degli acidi grassi, mentre la S-adenosin–metionina (SAM) è un donatore ubiquitario di gruppi metilici.

È stato dimostrato che LuxI poduce il 3O-C6-HSL dal 3ossoesanoil-proteina trasportatrice di acili (ACP) e S-adenosilmetionina (Hanzelka and Greenberg, 1996) (fig. 1- 8).

Gli autoinduttori prodotti dalle proteine omologhe a LuxI, sono simili per struttura chimica e sono tutti formati da un N acil-L-omoserina lattone con differenza di lunghezza della catena di acili.

Gli autoinduttori sono molecole estremamente mobili e possono facilmente permeare la membrana. In oltre sono composti biologici labili. L’anello lattonico, infatti, è soggetto all’idrolisi alcalina (Voelkert et Grant, 1970).

Inoltre, altri fattori possono influenzare l’effetiva concentrazione degli HSL, in modo sia positivo che negativo. C’è l’evidenza per esempio, che le lattonasi o altri enzimi possono degradare l’autoinduttore. È stato anche dimostrato che i furanoni alogenati interferiscono con la comunicazione batterica. Infatti, spiazzano i normali ligandi dalle proteine della famiglia LuxR e promuovono la loro rapida degradazione (Manefield et al., 1999).