Modulazione dell’espressione di MSRVenv e sincitina-1 da parte della EBVgp350 nelle PBMC.

In letteratura è riportato che l’HSV-1 ha la capacità di riattivare elementi HERV-W (Perron H. et al., 1997a; Ruprecht et al., 2006), e che l’EBV è in grado di attivare nei linfociti B il gene env dell’HERV-K18, attraverso il legame al recettore CD21 (Hsiao et al., 2006).

E’ stato quindi valutato l’effetto della EBVgp350 sull’espressione dei due retroelementi. HERV-W nelle PBMC.

Le cellule mononucleate da sangue periferico prelevate da donatori MSRV-positivi, le cellule B, le cellule T, i monociti, le NK, da esse derivate, sono state seminate in piastra e successivamente insieme agli MDM in quinta giornata, esposte a dosi scalari della proteina ricombinante EBVgp350 (10-30-100 ng/ml) per 24h. Il giorno successivo le colture sono state raccolte per la successiva estrazione degli RNA messaggeri seguita da retrotrascrizione ed amplificazione mediante Real Time PCR.

I risultati illustrati della Figura 11 evidenziano che anche nelle cellule circolanti si ha la stimolazione dell’espressione di MSRVenv e di sincitina-1 da parte di EBVgp350. In particolare nella Figura 11a si osserva un effetto dose-dipendente per le PBMC totali, che presenta il picco di espressione massima alla concentrazione di 30ng/ml, con andamenti sostanzialmente simili per entrambi i retroelementi.

Analizzando l’effetto sulle singole sottopopolazioni, si osserva nei linfociti B (Figura 11b), nei monociti (Figura 11c) e nei macrofagi da essi derivati (Figura 11f) una iper-regolazione dose-dipendente. Da notare che in questo caso il gene della sincitina-1 è più stimolato dalla EBVgp350 rispetto a MSRVenv.

I linfocitiT (Figura 11a), che di base non esprimevano trascritti di HERV-Wenv, non risentono dell’esposizione alla EBVgp350, come anche le NK (Figura 11d), che invece presentavano livelli basali di espressione per entrambi i geni.

6. DISCUSSIONE

I retrovirus endogeni umani della famiglia HERV-W, MSRV (capostipite della famiglia, che produce virioni extracellulari) ed ERVWE1 [situato sul cromosoma 7q21– 22, in una regione di candidata suscettibilità genetica per la SM (Blaise et al., 2003; 2004) che esprime solo il gene env, detto sincitina-1, a livello della membrana cellulare] sono stati da tempo correlati alla patogenesi della SM e proposti come possibili co- fattori ambientali scatenanti i fenomeni immunopatogenetici alla base della malattia, in presenza di un contesto genetico di predisposizione (Antony et al., 2004; Dolei, 2005; 2006; Dolei et al., 2002; Dolei e Perron, 2009; Perron et al., 1997a).

MSRV è presumibilmente un virus completo, in grado di rilasciare virioni liberi, la cui presenza nel sangue e nel liquor è strettamente correlata all’insorgenza e all’andamento della SM (Dolei et al., 2002; Komurian-Pradel et al., 1999; Mameli et al., 2008; Perron et al., 1989;1997b; Sotgiu et al., 2002; 2006a; 2010).

Allo stato attuale delle conoscenze infatti, è stata riscontrata da diversi gruppi la presenza di MSRV/HERV-W extracellulare nel sangue e nel liquor (CSF) di pazienti SM in quantità superiori rispetto ai controlli (Arru et al., 2008; de Villiers et al., 2006; Dolei et al., 2002; Garson et al., 1998; Nowak et al., 2003; Perron et al., 1997b; Serra et al., 2001). Il carico virale di MSRV è stato inoltre significativamente associato alla SM in tutti i gruppi etnici studiati (Arru et al., 2008; Mameli et al., 2007a). Il rilevamento di MSRV nel liquor di pazienti SM è stato associato con un aggravamento delle condizioni del paziente (Sotgiu et al., 2002; 2006a; 2010). Infatti, i soggetti SM che presentavano MSRV nel liquor, mostravano ai successivi controlli clinici, effettuati dopo 2, 6 e 10 anni, una progressione più severa della malattia, suggerendo che MSRV possa essere considerato come indicatore prognostico negativo (Dolei e Perron, 2009). Questi dati sono stati avvalorati da un nostro studio longitudinale, effettuato su campioni di sangue di una corte di pazienti SM in terapia con IFN-β, dal quale è emerso che: il carico di MSRV nel plasma dei pazienti naive è direttamente collegato con la pregressa durata della SM; la terapia con IFN-β riduce velocemente la viremia sotto i limiti di rilevamento, mentre l’aumento dell’indice di progressione e l’insuccesso della terapia sono accompagnati da una nuova produzione di MSRV (Mameli et al., 2008).

Il ruolo di MSRV nella SM, come cofattore o epifenomeno, non è ben definito, anche se il suo legame con la malattia appare evidente e statisticamente significativo (Dolei, 2006; Dolei e Perron, 2009).

Le proteine env dei retrovirus hanno potenziali proprietà immunopatogeniche, e possono causare neuroinfiammazione, neurodegenerazione ed induzione di risposte da stress del reticolo endoplasmatico (Antony et al., 2007a).

MSRV produce virioni extracellulari con proprietà gliotossiche (apoptotiche), fusogeniche (Perron et al., 1997b), superantigeniche (Arad et al., 2000; Perron et al., 2001a; Zhang et al., 1995) e in vivo è responsabile dell’immunopatogenicità mediata dalle cellule T (Firouzi et al., 2003).

Attività sorprendentemente concordanti con le proprietà di MSRV sono state osservate per quanto riguarda la sincitina–1. Essa è coinvolta nell’impianto dell’embrione durante le prime fasi della gravidanza (Mi et al., 2000), ma è espressa anche nei cervelli di pazienti SM (Antony et al., 2007b); negli astrociti modula una cascata infiammatoria, conducendo ad effetti lesivi sulle proteine degli oligodentrociti, cellule deputate alla formazione della mielina (Antony et al., 2004; 2007a). Come precedentemente indicato per MSRV (Serra et al.,2003), le citochine nocive nella SM attivano anche il promotore della sincitina-1, mentre l’IFN-β che è protettivo nei confronti della SM (utilizzato nella terapia della malattia) ha attività inibitoria (Mameli et al., 2007b). A livello di RNA, MSRVenv e sincitina-1 presentano una elevata omologia (>95%); quindi, a livello intracellulare, in assenza di anticorpi specifici o di primers selettivi in grado di discriminare tra ERVWE1 e MSRVenv, questi non possono essere differenziati l’uno dall’altro (Perron et al., 2005). Il nostro gruppo è riuscito a mettere a punto un sistema di Real Time PCR discriminante, per la rilevazione differenziale di MSRVenv e sincitina-1, basato su un’inserzione di 12 nucleotidi presente nella regione citoplasmatica di env di MSRV, ed assente nella sincitina-1 (Mameli et al., 2007a, 2009). Avvalendoci di questa nostra metodica, abbiamo condotto uno studio su campioni di sangue provenienti da 8 pazienti SM (4 in terapia e 4 naive), 8 controlli (6 donatori sani di sangue e 2 operatori sanitari), e 3 campioni autoptici cerebrali provenienti da pazienti SM. I risultati ottenuti hanno evidenziato che, sia MSRVenv che sincitina-1 sono espressi nel cervello dei pazienti, mentre solo MSRV si trova nel plasma. Il carico viremico di MSRVenv è ridotto o assente in pazienti in terapia. MSRV è rilasciato anche da PBMC di soggetti sani producenti virus MSRV, in

cui abbiamo rilevato anche la proteina env. Infine, va notato il fatto che il numero di copie di MSRVenv nel DNA dei pazienti è stato trovato ~6 volte superiore a quello dei controlli sani, mentre quello della sincitina-1 resta invariato (Mameli et al., 2009).

Alcuni studiosi ritengono che un retrovirus che si comporti come i retrovirus umani conosciuti, non possa, da solo, essere il fattore ambientale scatenante la SM, anche se presente in soggetti geneticamente predisposti a contrarre la malattia. Questi ricercatori hanno proposto un’ipotesi d’infezione multipla, che vede implicati, oltre ad un retrovirus, anche altri virus; ciò porta a considerare che l’infezione con un retrovirus associato alla SM sia un prerequisito necessario allo sviluppo della malattia, ma che questa si sviluppi solo in soggetti geneticamente suscettibili che, durante l’infanzia o l’adolescenza, siano stati infettati da un virus come, ad esempio, l’EBV (Munch et al., 1997; Perron et al., 2009).

Sono stati pubblicati numerosi studi sulla correlazione tra il virus di Epstein-Barr e la SM. Studi epidemiologici hanno evidenziato che individui con una storia di mononucleosi infettiva hanno rischio due-tre volte superiore di sviluppare la SM rispetto ai soggetti che hanno acquisito il virus in maniera asintomatica, (Ascherio e Munger, 2010). Studi sieroepidemiologici ed immunologici hanno evidenziato un'alterata immunoreattività per EBV in pazienti SM (Ascherio et al. 2001; DeLorenze et al., 2006; Levin et al. 2005). Inoltre studi longitudinali hanno mostrato che il titolo anticorpale anti-EBV aumenta molto prima dell'esordio della SM; ciò indica che l'aumentata immunoreattività per EBV è un evento precoce, precedente la SM, più che una conseguenza della malattia (Ascherio et al. 2001). Nelle meningi di un gruppo di pazienti con SM secondaria-progressiva (quindi in fase avanzata di malattia) sono stati evidenziati follicoli linfoidi ectopici, ricchi di infiltrati di cellule B e plasmacellule EBV(+)(Serafini et al., 2007; 2010).

Nonostante i vari studi epidemiologici dimostrino l’esistenza di un’associazione tra EBV e SM, è tuttavia ancora non dimostrato il ruolo di EBV come agente causale o cofattore, né EBV viene espresso nella SM.

Lo studio riportato nella presente tesi si basa sull’ipotesi che EBV possa agire indirettamente, attivando l’espressione degli HERV-W, che hanno dimostrate proprietà neuropatogene (Dolei e Perron, 2009), fondata sul fatto che è stato rilevato che EBV è in grado di transattivare in cellule B un altro retroelemento, HERV-K18, (Hsiao et al

2006). Sono stati scelti come modelli cellulari le PBMC e la linea di astroglioma umano U-87MG, che esprimono entrambi i retroelementi.

La scelta delle cellule astrocitarie è stata motivata dal fatto che vi sono forti evidenze che ne suggeriscono un ruolo chiave nella SM, in quanto facilitano il reclutamento e il mantenimento di leucociti pro-infiammatori a livello del SNC. Da un nostro studio è emerso che MSRV/HERV-Wenv è iper-espresso negli astrociti delle lesioni SM rispetto ai controlli (sani e patologici) (Mameli et al., 2007). Questo è stato osservato sia attraverso la rilevazione di un maggior accumulo di trascritti dei geni env e pol di HERV-W negli SM rispetto ai controlli, che a livello di traduzione di tali trascritti, in quanto nel tessuto cerebrale dei pazienti è stata rilevata immuno-reattività all’anticorpo anti-HERV-env localizzata a livello degli astrociti e microglia, ma assente nei controlli (Mameli et al., 2007). Questi risultati sono in accordo con altri studi sui cervelli SM, che mostrano l’accumulo di env di HERV-W sia come RNA che come proteina in astrociti e microglia (Antony et al., 2004; Perron et al., 2005). Inoltre in letteratura è riportato che il virus di Epstein-Barr è in grado di infettare gli astrociti (Menet et al.,1999) ed che essi esprimono il recettore CD21 (Gasque et al., 1996).

Dopo aver verificato la presenza del recettore CD21 nella nostra linea cellulare e di un espressione di base dei due retroelementi sia come produzione intracellulare di trascritti sia come presenza della proteina env sulla membra cellulare, abbiamo valutato gli effetti di EBV sull’espressione degli HERV-W.

Da uno studio inziale con il virus EBV in toto, in esperimenti di co-coltivazione degli astrociti con le cellule EBV-producenti B95-8 abbiamo osservato un aumento significativo dell’espressione dei due retroelementi mettendo così in luce un effetto modulatorio da parte del virus. A questo punto ci siamo chiesti se per l’attivazione degli HERV-W fosse sufficiente il legame di EBV alle cellule astrocitarie. A tale scopo sono stati valutati gli effetti della proteina EBVgp350 sull’espressione dei due retroelementi. Anche in questo caso abbiamo osservato un effetto stimolatorio sull’espressione di MSRVenv e sincitina-1. Tale effetto compare precocemente ed è massimo alle 24h e viene abolito in seguito al pretrattamento della proteina con il suo anticorpo neutralizzante, confermandone la specificità d’azione.

Questi dati ci fanno ipotizzare che ci sia un coinvolgimento diretto della proteina EBVgp350 nel meccanismo molecolare di attivazione dei due elementi HERV-W da parte di EBV.

La glicoproteina gp350 di EBV ha la capacità di indurre, attraverso il legame al recettore CD21 cellulare, l’attivazione e quindi la traslocazione nel nucleo del fattore di trascrizione NF-κB (Hsiao et al., 2006). Abbiamo osservato che il silenziamento della subunità p65 del fattore di trascrizione NF-κB in presenza della EBVgp350, impedisce la stimolazione dell’espressione dei trascritti del gene env dei due retroelementi da parte della proteina. Ciò dimostra che il suddetto fattore di trascrizione ha un ruolo nell’espressione di MSRVenv e sincitina-1, non sappiamo ancora se diretto o indiretto. Questi dati suggeriscono che l’EBV possa attivare negli astrociti l’espressione dell’env di HERV-W, tramite il legame della sua proteina gp350 al CD21 via NF-κB. La proteina env ha mostrato effetti pro-infiammatori, gliotossici e superantigenici in vitro e potrebbe indurre nei pazienti SM un danno agli oligodendrociti, con conseguente infiammazione, demielinizzazione e danno assonale.

Nella seconda parte del nostro studio abbiamo studiato l’espressione degli HERV-W nelle PBMC, quindi a livello periferico.

Preliminarmente abbiamo valutato l’espressione basale dei due elementi HERV-W, sia come produzione intracellulare di trascritti sia come presenza della proteina env sulla membrana cellulare, studiando anche la variazione dell’espressione dei retroelementi HERV-W nelle varie sottopopolazioni di PBMC. Dall’analisi dei dati è emerso che, sia a livello di RNA che di proteina, entrambi i retroelementi sono espressi di base nelle PBMC, ma analizzando le singole sottopopolazioni è apparso evidente che i trascritti di MSRVenv e sincitina-1 sono presenti in tutte le popolazioni studiate eccetto nei linfociti T. Questi dati sono in accordo con quelli presenti in letteratura (Brudek et al., 2009), ma evidenziano per la prima volta l’espressione dei due retroelementi anche nelle cellule NK.

Abbiamo quindi verificato l’effetto di EBV e della sua proteina gp350 sull’espressione dei due elementi HERV-W. I risultati, in accordo con quanto ottenuto per gli astrociti, evidenziano che nelle PBMC la proteina esercita un effetto stimolatorio sull’espressione di MSRVenv e di sincitina-1. Analizzando l’effetto sulle singole sottopopolazioni, abbiamo osservato che l’aumento di espressione di MSRVenv e di sincitina-1 avviene soprattutto a carico di linfociti B, monociti (e anche di monociti differenziati in macrofagi (MDM), ma non dei linfociti T e delle NK. Queste ultime due sottopopolazioni probabilmente non risentono dell’esposizione alla EBVgp350 a causa

di una bassa espressione del recettore CD21 sulla membrana citoplasmatica nelle cellule T (Kaya et al., 2005) e della sua assenza nelle NK (Isobe et al., 2004).

I dati della presente tesi dimostrano che EBV è in grado di stimolare l’espressione di HERV-W sia in astrociti che in PBMC, ed ipotizziamo che ciò possa verificarsi, in modo anomalo, anche in vivo, soprattutto nel corso dell’infezione da EBV, non di bambini, ma di giovani adulti, in cui l’infezione primaria è sintomatica, causando la mononucleosi infettiva. È infatti la pregressa sieroconversione tardiva contro EBV, e non l’espressione di EBV all’esordio o nelle riacutizzazioni della SM, ad essere stata correlata con chiarezza alla successiva insorgenza, anni dopo, della malattia.

I risultati ottenuti, rafforzano quindi l’ipotesi di un possibile coinvolgimento di questi virus nella patogenesi della SM, avvalorando quindi la tesi che i fenomeni immunopatogenici alla base della malattia possano essere determinati da un superantigene codificato da un retrovirus endogeno della famiglia HERV-W, transattivato dall’Herpesvirus di Epstein-Barr.

7. Bibliografia

Ablashi DV, Lapps W, Kaplan M, Whitman JE, Richert JR, Pearson GR. Human

herpaesvirus-6 (HHV-6) infection in multiple sclerosis: a preliminary report. Mult. Scler. 4: 490-496, 1998.

Alotaibi S, Kennedy J, Tellier R, Stephens D, Banwell B. Epstein-Barr virus in

pediatric multiple sclerosis. JAMA. 291(15): 1875-9, 2004

Alter M, Halpern L, Kurland LT, Bornstein B, Tikva P, Leibowitz U, Silberstein J.

Multiple sclerosis in Israel: prevalence among immigrants and native inhabitants. Arch. Neurol. 7: 253-263, 1962.

Alter M, Okihiro M. When is multiple sclerosis acquired? Neurol. 21: 1030-1036,

1971.

Alvarez-Lafuente R, De las Heras V, Bartolome M, Picazo, J.J, and Arroyo R.

Relapsing-remitting multiple sclerosis and human herpesvirus 6 active infection. Arch. Neurol. 61: 1523-1527, 2004.

Alvarez-Lafuente R, De las Heras V, Garcia-Montojo M. Human herpesvirus-6 and

relapsing-remitting versus secondary progressive. Mult Scler: clinc Lab Res. 13 : 578- 583, 2007.

Andersen O, Lygner PE, Bergström T, Andersson M, Vahlne A.Viral infections trigger

multiple sclerosis relapses: a prospective seroepidemiological study. J. Neurol. 240: 417-422, 1993.

Andersson Ml, Medsrand P, Yin H, Blomberg J. Differential expression of human

endogenous retrovirus sequences similar to mouse mammary tumor virus in normal peripheral blood mononuclear cells. AIDS Res Hum Retroviruses.12: 833-840, 1996.

Antony JM, DesLauries A, Bhat Rk, Ellestad KK, Power C. Human Endogenous

Retrovirus and multiple sclerosis: Innocent bystanders or disease determinant? Biochimica Biophysica Acta. 1812 162-176, 2010.

Antony JM, Ellestad KK, Hammond R, Imaizumi K, Mallet F, Warren KG, Power C.

The human endogenous retrovirus envelope glycoprotein, syncytin-1, regulates neuroinflammation and its receptor expression in multiple sclerosis: a role for endoplasmic reticulum chaperones in astrocytes. J. Immunol. 179: 1210–1222, 2007a.

Antony JM, Izad MA, Bar-Or A, Warren KG, Vodjani M, Mallet F, Power C.

Comparative expression of Human Endogenous Retrovirus-W Genes in Multiple Sclerosis. Aids Res. And Human retrovir. 23(10): 1251-1256, 2007b.

Antony JM., Izad M, Bar-Or A, Warren KG, Vodjgani M, Mallet F, Power C.

Quantitative analysis of human endogenous retrovirus-W env in neuroinflammatory diseases. AIDS Res Hum Retroviruses. 22: 1253-1259, 2006.

Antony JM, Van Marle G, Opii W, Butterfield DA, Mallet F, Yong VW, Wallace JL,

Deacon RM, Warren K, Power C. Human endogenous retrovirus glycoprotein-mediated induction of redox reactants causes oligodendrocyte death and demyelination. Nat. Neurosci. 7: 1088-1095, 2004.

Arad G, Levy R, Hillman D, Kaemptfer R. Superantigen antagonist protects against

lethal shock and defines a new domain for T-cell activation. Nat. Med. 6: 414-421, 2000.

Arru G, Mameli G, Astone V, Serra C, Huang YM, Link H, Fainardi E, Castellazzi M,

Granieri E, Fernandez M, Villoslada P, Fois ML, Sanna A, Rosati G, Dolei A, Sotgiu S. Multiple sclerosis and HERV-W/MSRV. A multicentric study. Intnl J. Biomed. Sci 4:100-105, 2008.

Ascherio A, and Munger KL. Epstein-Barr virus infection and multiple sclerosis: A

Ascherio A. and Munger KL. Environmental risk factors for multiple sclerosis. Part I:

the role of infection. Ann Neurol. 61: 288-299, 2007a.

Ascherio A, and Munger KL. Environmental risk factors for multiple sclerosis. Part II:

Noninfectious factor. Ann Neurol. 67: 504-5013, 2007b.

Ascherio A, Munger KL, Lennette ET, Spiegelman D, Hernan MA, Olek MJ,.

Hankinson SE, and. Hunter DJ. Epstein-Barr virus antibodies and risk of multiple sclerosis: a prospective study. JAMA. 286: 3083–3088, 2001.

Balada E, Vilardell-Tarrès M, Ordi-Ros J. Implication of Human endogenous retrovirus

in the development of autoimmune deseases. Int Rev Immunol. 29(4): 351-70, 2010.

Bannert N, Kurth R. Retroelements and the human genome: new perspectives on an old

relation. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101 Suppl. 2: 14572-14579, 2004.

Belshaw R, Katzourakis A, Paces J, Burt A, Tristem M. High copy number in Human

Endogenous Retrovirus is associated with copying mechanisms in addition to reinfection. Mol Biol Evol. 22: 814-8817, 2005.

Blaise S, de Parseval N, Benit L, Heidmann T. Genome wide screening for fusogenic

human endogenous retrovirus envelopes identifies syncytin 2, a gene conserved on primate evolution. Proc Natl Acad Sci USA. 100: 13013-13018, 2003.

Blaise S, Ruggieri A, Dewannieux M, Cosset FL, Heidmann T. Identification of an

Envelope Protein from the FRD Family of Human Endogenous Retroviruses (HERV- FRD) Conferring Infectivity and Functional Conservation among Simians. J. Virol. 78: 1050–1054, 2004.

Blond JL, Beseme F, Duret L, Bouton O, Bedin F, Perron H, Mandrand B, Mallet F.

Molecular characterisation and placental expression of HERV-W, a new human endogenous retrovirus family. J. Virol. 73: 1175-1185, 1999.

Boeke JD. Retrotrasposons. In: Domingo E, Holland JJ, Ahlquist P (ed.). RNA

Genetics, vol. II. Retroviruses, viroids, and RNA recombination. Boca Raton, FL: CRC Press: 59-103, 1988.

Bosch E, Jobling MA. Duplications of the AZF a region of the human Y chromosome

are mediated by homologus recombination between HERVs and are compatible with male fertility. Hum. Mol. Genet. 12: 341-347, 2003.

Brdar B. Induction of plasminogen activator by alkylating agents in a repair defective

human glioblastoma cell strain. Cancer Res. 46(5):2282-4), 1986.

Brudek T, Christensen T, Hansen HJ, Bobecka J, Moller-Larsen A. Simultaneous

presence of endogenous retrovirus and herpes virus antigens has profound effect on cell- mediated immune responses: implications for multiple sclerosis. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 20: 415-423, 2004.

Brudek T, Christensen T, Aagaard L, Petersen T, Hansen HJ, Møller-Larsen A. B cells

and monocytes from patients with active multiple sclerosis exhibit increased surface expression of both HERV-H Env and HERV-W Env, accompanied by increased seroreactivity. Retrovirology. 16;6: 104, 2009

Carson MJ. Microglia as liaisons between the immune and central nervous systems:

functional implications for multiple sclerosis.Glia. Nov. 40(2): 218-31, 2002.

Challoner PB, Smith KT, Parker JD, MacLeod DL, Coulter SN, Rose TM, Schultz ER,

Bennet JL, Garber RL, Chang M. Plaque-associated expression of human herpesvirus 6 in multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci USA. 92: 7440-7444, 1995.

Christensen T. Association of human endogenous retroviruses with multiple sclerosis

and possible interactions with herpes viruses. Rev Med Virol. 15: 179-211, 2005.

Christensen T. HERVs in Neuropathogenesis. J.Neuroimmune Pharmacol.1481-010-

Christensen T, Pedersen L, Sorensen PD, Moller-Larsen A. A transmissible human

endogenous retrovirus. AIDS Res Hum Retroviruses. 10 ; 18 (12): 861-6, 2002.

Clark D, Human herpesvirus type 6 and multiple sclerosis. Herpes. Suppl. 2: 112A-

119A, Review 2004.

Clausen J. Endogenous retroviruses and MS: using ERVs as disease markers. Int. MS

J. 10: 20-21, 2003.

Coffin JM. Genetic diversity and evolution of retroviruses. Curr. Top Microbiol.

Immunol. 176: 143-164,1992.

Coffin JM. Reverse transcription and evolution. In Goff S, Skailka AM, (ed). Reverse

transcriptase. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press. 445-479, 1993.

Cohen JI. Epstein-Barr virus infection. N. Engl. J. Med. 343: 481–492, 2000.

Compston DAS, Vakarelis BN, Paul E, McDonald WI Batchelor JR, Mims CA. Viral

infection in patients with multiple sclerosis and HLA-DR matched controls. Brain. 109: 325-344, 1986.

Costas J. Characterization of the intragenomic spread of the human endogenous

retrovirus family HERV-W. Mol. Biol. Evol. 19: 526-533, 2002.

Dean G. Annual incidence, prevalence and mortality of multiple sclerosis in White

South-African-born and in white immigrants to South Africa. Br Med J. 2: 724-730, 1967.

Dean G, Grimaldi G, Kelly R, Karhausen L. Multiple Sclerosis in Southern Europe. I.

Prevalence in Sicily in 1975. J Epidemiol Community Health. 33: 110-113, 1979.

Deininger PL, Batzer MA. Mammalian retroelements. Genome Res. 12: 55-1465,

DeLorenze GN, Munger KL, Lennette ET, Orentreich N, Vogelman JH, Ascherio A.

Epstein-Barr virus and multiple sclerosis: evidence of association from a prospective study with long-term follow-up. Arch. Neurol. 63: 839–844, 2006.