Molecular modeling e analisi strutturale

Per ottenere informazioni strutturali circa le modalità di coordinazione dei sistemi in esame, è stato effettuato per L8 e L9 uno studio di molecular modelling, mediante calcoli di dinamica molecolare con simulazione implicita del solvente sugli addotti LH66+-XTP, operando una ricerca conformazionale mediante la tecnica del ‘simulated annealing’ (SA). E’ stato visto che i

geometrie di coordinazione, ed è stato possibile per ciascun sistema individuare due famiglie strutturali denominate con le lettere A e B; di seguito sono riportati i conformeri a minima energia per ogni famiglia dei quattro addotti simulati (distanze <2 Å, ad eccezione dei legami a idrogeno coinvolgenti gruppi funzionali delle nucleobasi, angoli di legame compresi tra 130-180°) (Fig.4.11-4.14).

A) 70% B) 30%

Fig. 4.11– Conformeri a minima energia per le famiglie A e B dell’addotto L9-ATP.

A) 35% B) 65%

A) 40% B) 60%

Fig. 4.13– Conformeri a minima energia per le famiglie A e B dell’addotto L9-GTP.

A) 30% B) 70%

Fig. 4.14– Conformeri a minima energia per le famiglie A e B dell’addotto L9-TTP.

E’ possibile osservare nelle figure riportate che il recettore tende ad assumere nei complessi una conformazione piegata, con una disposizione pressoché perpendicolare tra il piano contenente l’unità fenantrolinica e il piano medio definito dalla catena poliammonica. In tutti i sistemi si osserva che il gruppo ribosio costituente il nucleotide assume una conformazione ‘syn’, che permette la simultanea interazione della nucleobase e della catena trifosfato con il recettore: il fosfato  risulta in questo modo incapsulato nella cavità del recettore e la nucleobase risulta disponibile per un’interazione di π-stacking con l’unità fenantrolinica. La famiglia denominata con A raccoglie per ogni

l’unità fenantrolinica del recettore, e risulta la più popolata unicamente per l’addotto con ATP (70%). Come è logico aspettarsi, le nucleobasi più estese (guanina ed adenina) instaurano una più decisa interazione di stacking con l’unità aromatica del recettore (distanza interplanare fenantrolina/base azotata, 3.3-3.4Å), come ben evidenziato dalla disposizione pressochè parallela delle nucleobasi rispetto all’unità fenantrolinica per gli addotti LH66+-ATP e LH66+-GTP (Fig. 4.11 e 4.13). I conformeri a minima energia appartenenti alle famiglie B dei quattro substrati mostrano, in luogo dell’interazione di stacking, un’interazione via legame a idrogeno tra gli atomi di ossigeno carbonilici di CTP, GTP e TTP, denominati come O8, l’atomo di azoto N9 dell’ATP, con un gruppo ammonico del recettore. In particolare, tutti i substrati instaurano legami a idrogeno coinvolgenti gli atomi di azoto in posizione benzilica del legante, denominati come N3 ed N8: l’addotto con ATP presenta però il maggior numero di interazioni via legame a idrogeno; queste interazioni, insieme alla alta percentuale di conformeri che mostrano un’interazione di π-stacking col recettore, possono spiegare la più elevata stabilità dell’addotto L9-ATP osservata in soluzione acquosa rispetto agli altri tre sistemi. Nel caso di GTP, si poteva attendere che, possedendo una nucleobase più estesa come adenina, la famiglia più popolata fosse la A. In realtà, la struttura della guanina è piuttosto ingombrata, per la compresenza dei gruppi C=O e –NH2. A differenza di ATP, nell’addotto di guanina con L9, questi due gruppi sono orientati verso la catena alifatica di L9. Quindi l’ingombro sterico tra la guanina e la parte alifatica di L9 giustifica questa scarsa tendenza di GTP a formare addotti con interazioni π-stacking. Nel caso di L8, si osservano conformazioni simili a quelle trovate per L9, ma in questo caso il maggior numero di conformeri è simile a quelli osservati per le famiglie B. Il risultato è in accordo con i dati 1_{H NMR. La differenza è riconducibile} alle minori dimensioni di L8 rispetto a L9. Per ottenere maggiori informazioni sulle caratteristiche strutturali degli addotti, si è tentato di ottenere cristalli degli addotti adatti all’analisi attraverso diffrattometria a raggi X da soluzioni acquose contenenti i nucleotidi e i recettori in rapporto molare 1:1. Nel caso del sistema TTP-L9 si sono ottenuti cristalli del composto [(H6L9)2(TTP)2-

[(H6L9)2(TTP)2(H2O)2]4+, quattro anioni bromuro e sette molecole di acqua di cristallizzazione (Fig. 4.15).

Tabella 4.5- Distanze dei legami a idrogeno per il catione [(H6L9)2(TTP)2(H2O)2]4+.

Atomi Distanza (Å) Atomi Distanza (Å)

N2a-O9b 2.75(1) N5b-O10a 2.69(2) N2b-O10a 2.76(1) N5b-O14a 2.75(3) N6a-O13b 2.63(2) N6b-O13a 2.70(2) N9b-O9a 2.78(3) N10a-Ow5 2.79(3) N8a-O7b 2.77(2) N8b-O12a 2.83(3) N8a-O14b 2.73(2) N8b-O6a 2.86(2) N5a-O2a 2.96(1) N7b-O7a 2.72(3) N5a-O9b 2.78(2) N10b-Ow6 2.76(3) N5a-O12b 2.82(2) N4a-Ow5 2.89(2) N7a-O6b 2.72(3) Ow5-O10b 2.94(2) N9a-O10b 2.61(3) N4b-Ow6 2.94(2) N5b-O2b 3.04(2) Ow6-O9a 2.87(2)

Il catione [(H6L9)2(TTP)2(H2O)2]4+, con simmetria di inversione non cristallografica, è formato da due recettori L9, due anioni TTP, due molecole di acqua, tenuti insieme da diversi legami a idrogeno e interazioni di natura -stacking. Ogni recettore assume una conformazione ripiegata attorno all’asse degli atomi di azoto benzilici, come osservato nei conformeri calcolati. I due recettori assumono una disposizione ciclica di tipo testa-coda e definiscoo una cavità tridimensionale in cui può essere ospitato il TTP. La catena trifosfato di ogni anione TTP risulta incapsulata nella cavità macrociclica di un recettore protonato dando luogo alla formazione di stretti ponti di idrogeno, mentre la sua base pirimidinica si trova chiusa a sandwich tra una unità fenantrolina dell’altro recettore e un gruppo timidina dell’altro anione TTP. Si ha una disposizione incolonnata di due unità fenantrolina e due unità timidina con interazioni -stacking con distanze interplanari di 3.3 Å tra i piani di fenantrolina e timidina e di 3.6 Å tra le due unità timidina. Si instaurano anche dei contatti di tipo legame a idrogeno indiretti, mediati da molecole di acqua, tra il P di ciascun TTP e gli atomi di azoto della fenantrolina (N4a o N4b) e i singoli gruppi ammonio benzilici (N10a o N19b). Infine i gruppi carbonile della timidina (O2a o O2b) interagiscono via legame

atomo di azoto della timidina (N2a o N2b) è legato via legame a idrogeno con il fosfato P di una diversa unità TTP. Le interazioni che si evidenziano in questa struttura cristallografica sono le stesse presenti nei conformeri calcolati. Anche se in letteratura si trovano molti studi riguardanti la complessazione di nucleotidi da parte di recettori poliammonici sintetici, in precedenza è stata riportata solo una struttura cristallina di questo tipo di addotti.9

Per il legante L10 sono state condotte simulazioni MD in vacuo usando un modello implicito di solvente acqua, e considerando il recettore HhLh+ (h=3, 4 e 6). Si è potuto notare che, in dipendenza dalla carica e dalla polarità del solvente, i due macrocicli laterali tendono ad allontanarsi all’aumentare della carica molecolare. Mentre in vacuo, nella forma H3L103+ _{il recettore si} presenta con una forma a calice, nella forma H6L106+ _{è completamente} aperto (Fig. 4.16).

Fig. 4.16- Rappresentazioni

delle conformazioni a

minima energia del recettore H3L103+in vacuo (a), di H6L106+in vacuo (b) e di H6L106+in un

modello implicito di solvente acqua.

conformazione a calice (Fig. 4.16c). In genere la forma H3L103+ _{risulta essere} quella più ingombrata, con i siti di legame che puntano verso l’interno della struttura molecolare. Sono state analizzate le interazioni tra le forme minimizzate di energia del recettore con i nucleotidi ATP e ADP. Per la forma H4L104+_{, indipendentemente dal mezzo, si vede che l’anione ADP più piccolo} interagisce solo con una interazione di legame a idrogeno tra un atomo di ossigeno del gruppo fosfato P e un gruppo NH2+. Nel caso di ATP si ha l’interazione dei due gruppi vicini P e P (Fig. 4.17). Per la forma H6L106+, più aperta, si vede che i protoni acidi del macrobiciclo centrale possono interagire con i guest, dando luogo a interazioni di tipo legame a idrogeno (distanza NH---O minore di 2.0 Å) con gli atomi di ossigeno dei gruppi fosfato di entrambi i nucleotidi. In solvente polare, gli anioni interagiscono via legame a idrogeno con un anello esterno del recettore che si trova a forma di calice (Fig. 4.18b).

Fig. 4.17- Conformeri a minima energia per i sistemi H4L104+/ADP3- (a) e H4L104+/ATP3- in

Fig. 4.18- Conformeri a minima energia per i sistemi H6L106+/HADP2-in vacuo(a) e H6L106+/

HADP2-_{in un modello implicito di solvente acqua.}