Mutagenesi sito-diretta

Progettazione dei primers per mutagenesi sito specifica

Una volta identificate le mutazioni nuove, sono stati sintetizzati i primers per realizzare la mutagenesi sito specifica, usando il kit QuikChange Site-Directed Mutagenesis della Stratagene (34) .

I primers sono stati progettati seguendo le indicazioni fornite dal kit:

- entrambi i primers devono contenere la mutazione puntiforme di interesse e devono appaiarsi alla stessa sequenza sugli opposti strand del plasmide;

- i primers devono avere una lunghezza compresa tra le 25 e le 45 bp e la temperatura di annealing non deve essere inferiore ai 78°C. Tale temperatura deve essere calcolata con la seguente formula:

Tm = 81,5 + 0,41 ( %GC) - 675/ N - % mismatch dove con N sono indicate il numero di bp del primer;

- la mutazione desiderata deve trovarsi al centro del primer con almeno 10-15 bp da ambo i lati;

- è preferibile che i primers abbiano un contenuto in GC pari al 40% e terminino con una G o una C.

Sono quindi state progettate 5 coppie di primers per le cinque mutazioni studiate, L122P, Q481X e M150R,E161X e R366H insieme ad un ulteriore coppia di primers per inserire la mutazione nota Q318X da usare come controllo negativo. L’incorporazione dei primers genera un plasmide mutato contenente un nick sul doppio filamento.

Parte Sperimentale Primers Sequenza 5’-3’ L122P-F GGAAAGCCCACAAGAAGCCACCCGCTCAGCCCTGC L122P-R GCAGGGCTGAGCGGGTGGGCTTCTTGTGGGCTTTCC Q481X-F CTTTCCAAGTGCGGCTGTAGCCCCGGGGATGG Q481X-R CCATCCCCCGGGGCTACAGCCGCACTTGGAAAAG M150R-F GGAGTTCTGTGAGCGCAGGAGAGCCCAGCCCGG M150R-R CCGGGCTGGGCTCTCCTGCGCTCACAGAACTCC

E161X-F GGCACCCCTGTGGCCATTTAGGAGGAATTCTCTCTCC

E161X-R CCGTGGGGACACCGGTAAATCCTCCTTAAGAGAGAGG

R366H-F CTTAGCCTTGCCCCACCACACCACACGGCCCAG

R366H-R GAATCGGAACGGGGTGGTGTGGTGTGCCGGGTC

Q318X-F GAGATTCAGCAGCGACTGTAGGAGGAGCTAGACCACG

Q318X-R CGTGGTCTAGCTCCTCCTACAGTCGCTGCTGAATCTC

PCR di mutagenesi

Sono state messe a punto le condizioni ottimali della PCR di mutagenesi, seguendo le indicazioni fornite dal protocollo della Ditta produttrice.

Le condizioni di PCR utilizzate per la mutagenesi del plasmide pCMV4-CYP21A2 sono state le seguenti:

PCR Mutagenesi Dimensioni Reaction buffer 10X 5 µl pCMV4-CYP 21A2 80 ng Primer F 1 µM Primer R 1 µM dNTPs mix 1 µl

Pfu Turbo DNA pol (2,5U/ µl) 1 µl ddH2O 50 µl Denaturazione Temp Time N° cicli 95°C 30’’ 1 95°C 30’’ 18 55°C 1’ 68°C 15 ‘

10 µl dei campioni di PCR sono stati controllati su gel d’Agarosio al 1%, previa colorazione con etidio bromuro. L’efficienza della reazione di mutagenesi è stata verificata mediante l’utilizzo del plasmide di controllo pWhitescript TM 4.5 kb, fornito dal kit. Tale plasmide contiene il gene

Parte Sperimentale che codifica per la β galattosidasi ma con un codone di stop (TAA) al posto di un codone CAA che normalmente codifica per la glutammina in posizione 9.

I primers forniti dal kit e specifici per questo plasmide inseriscono una mutazione puntiforme che converte la T del codone di stop TAA nella C, generando un gene della β galattosidasi funzionale.

Ai prodotti di PCR è stato aggiunto 1 µl dell’enzima DpnI, un’endonucleasi specifica per il dsDNA metilato, utilizzato per frammentare il plasmide template per la PCR di mutagenesi. I campioni, agitati e centrifugati per 1’ a 13000 rpm, sono stati posti a 37°C per 1 ora.

Trasformazione e sequenziamento dei plasmidi mutati

Aliquote di 50 µl di cellule Epicurian Coli XL-Blue fornite dal kit di mutagenesi sono state poste in Falcon 2059 e usate per le trasformazioni mediante la metodica dello Shock termico descritta in precedenza (33). Le cellule, una volta incorporato il plasmide mutato ne saldano la rottura, generando un plasmide integro contenente la mutazione. Come da protocollo fornito dal kit, sono stati aggiunti in ogni aliquota 1 µl di PCR trattata con DpnI.

50 µl di cellule + 1 µl di pWhitescript TM 4.5 kb mutato 50 µl di cellule + 1 µl di pCMV4-CYP21A2

50 µl di cellule + 1 µl di pCMV4-CYP21A2 - L122P 50 µl di cellule + 1 µl di pCMV4-CYP21A2 - Q481F 50 µl di cellule + 1 µl di pCMV4-CYP21A2 - M150R 50 µl di cellule + 1 µl di pCMV4-CYP21A2 – E161X 50 µl di cellule + 1 µl di pCMV4-CYP21A2 – R366H

50 µl di cellule + 1 µl di pCMV4-CYP21A2 - Q318X (controllo negativo)

Le cellule trasformate con il plasmide di controllo pWhitescript TM 4.5 kb codificano una β galattosidasi funzionale e generano colonie blue in LB+Agar contenente IPTG (isopropil- 1-tio-β- D-galattopiranoside). Sull’ LB+Agar solidificato sono stati stesi 100 µl di LB in cui sono stati aggiunti 20 µl di X-gal 10%, stoccato in dimetilformamide, e 20 µl di IPTG 0,1 M stoccato in dH2O. Questo ha permesso di verificare l’efficienza di mutagenesi, calcolata con la formula seguente:

Parte Sperimentale Tre colonie cresciute in ogni piastra sono state inoculate in 3 ml LB in tubi Falcon da 15 ml, contenente Ampicillina in concentrazione 1:1000. Ogni inoculo è stato verificato mediante PCR e sequenza per confermare l’esatta sequenza di tutto il cDNA della CYP21A2 e l’inserimento della mutazione voluta.

I primers per la PCR sono stati scelti in modo da amplificare una regione che contenesse tutte e cinque le mutazioni di interesse.

Primer Posizione Sequenza

(5’-3’)

D Esone 3 CCGGACCTGTCCTTGGGAGACTACT

G Esone 8 GCCGTGTGGTGCGGTGGGGCAAGGCTAA

L Esone 6 GAT CAC ATC GTG GAG ATG CAG

Purificazione dei plasmidi

Dei 3 ml inoculati a 37°C o/n, 1,5 ml vengono utilizzati per verificare la presenza del plasmide nelle colonie inoculate, mediante protocollo QiaPrep Spin Miniprep della Qiagen. Le Mini sono state controllate su gel d’Agarosio 1% previa colorazione con etidio bromuro e dopo digestione con gli enzimi BglII e Hind III per il plasmide pCMV4 e HindIII e BamHI per il plasmide pSV-β-galattosidasi, per verificare la presenza dell’inserto (Figura12 ). Le digestioni sono state poste a 37°C per un’ora.

A) B) 1Kb WT L122P M150R Q481F Q318X E161X _R366H Figura 12: Risultato delle MINI fatte sugli inoculi di 3 ml di alcune delle colonie cresciute.

a – MINI di alcune colonie trasformate con il plasmide pCMV4-CYP21A2 WT e delle colonie trasformate

con i plasmidi mutagenizzati

Parte Sperimentale Il rimanente è stato inoculato in beute contenenti 250 ml di LB con ampicillina 1:1000 e posto a 37°C o/n, per l’esecuzione della purificazione dei plasmidi mediante Kit Qiafilter Plasmid Maxi della Qiagen ( Figura 13 ).

I plasmidi sono stati quindi dosati mediante spettrofotometro e controllati come già indicato per la presenza dell’inserto.

Dosaggio Maxi

Campioni A260 A260/280 [ ] µg/ µl

pCMV4-CYP21A2WT 0,3 1,78 1,5 pSV-β-galattosidasi 0,418 1,79 2 pCMV4-CYP21A2 L122P 1,68 1,7 8,4 pCMV4-CYP21A2 Q481X 1,874 1,7 9,37 pCMV4-CYP21A2 M150R 0,198 1,6 0,99 pCMV4-CYP21A2 R366H 1,22 1,7 6,1 pCMV4-CYP21A2 E161X 1,6 1,7 8 pCMV4-CYP21A2 Q318X 1 1,68 5 L122P M150R R366H E161X Β-gal Q381X Q481X WT 1Kb L122P 1Kb WT Q481X M150R R366H E161X B-gal Q318X

Figura 13: MAXI del plasmide pCMV4-CYP21A2 WT, dei plasmidi mutagenizzati e del pSV-β- galattosidasi

Parte Sperimentale

3.

La linea cellulare COS7 è stata fornita dall’American Type Tissue Collection (Manassas, VA, U.S.A.) ( Figura 14 ). Le cellule, di morfologia fibroblastica, crescono come clusters aderendo leggermente al substrato. Derivano da cellule renali di Cercopithecus aethiops, la scimmia verde africana, trasfettate con un virus SV40 difettivo ma codificante un antigene T wild type (26,30).

Figura 14: COS7

Le cellule COS7 sono state cresciute in terreno di coltura DMEM, Dulbecco’s modified Eagle’s medium only (GIBCO) ad elevato glucosio e con NEAA, con aggiunta di siero fetale bovino (FBS) al 10% inattivato (GIBCO), 2mM glutammina (Euroclone Devon, U.K.), Pen/Strep in concentrazione finale 1:1000 e 1 mM di Sodio Piruvato. Le cellule sono incubate in atmosfera umida con CO2 al 5% a 37°C ed hanno un tempo di duplicazione di circa 48 ore. La vitalità cellulare è stata determinata mediante la tecnica di esclusione del colorante vitale Tripan-Blue (0.4% p/v) effettuata nella camera citometrica di Bürker.

Le cellule sono state seminate ad una concentrazione di 2x105 su una multiwell da 3,5 cm di diametro (Falcon) in terreno DMEM completo e dopo un’incubazione di 24 ore sono state trasfettate mediante lipofectamina. La lipofectamina è una sospensione di fosfolipidi usata per le trasfezione di acidi nucleici in cellule eucariotiche.

Parte Sperimentale La lipofectamina forma complessi con il DNA e penetra nelle cellule attraverso la membrana plasmatica portando il DNA esogeno nel citoplasma (26,28,30).

La trasfezione transiente è stata realizzata usando 4 µg di ciascun DNA plasmidico, trasfettando il plasmide vuoto pCMV4, il pCMV4-CYP21A2-WT (CYP21-WT), i diversi costrutti (CYP21-L122P, CYP21-M150R e CYP21-Q481X, CYP21-E161X, CYP21-R366H) ed il plasmide di controllo negativo (CYP21-Q318X).

Per monitorare l’efficienza di trasfezione, è stato utilizzato il plasmide di controllo pSV-β- galattosidasi fornito dalla Promega insieme al kit per il saggio β-galattosidasi (25,30).

Come da protocollo, le quantità di DNA e di lipofectamina sono state scelte in rapporto 1:2. Le cellule sono state trasfettate ad una confluenza dell’80%, per garantire la sopravvivenza delle stesse ed un’espressione efficiente dell’enzima.

- Il DNA e la lipofectamina sono state incubate separatamente a temperatura ambiente per 5’; - DNA e lipofectamina sono stati uniti e incubati 20’ a temperatura ambiente. Durante

l’incubazione le provette sono state agitate delicatamente per facilitare la formazione dei complessi DNA-lipofectamina;

- Le cellule COS7 sono state sottoposte ad un lavaggio con 2 ml di PBS ed è stato aggiunto 1 ml di DMEM con glutammina allo 0,1%, in assenza di siero e di antibiotici;

- Le cellule sono state incubate in presenza dei complessi DNA-lipofectamina per 5 ore a 37°C, poi rimossi con sostituzione del terreno DMEM completo. Dopo 48 ore abbiamo proceduto alla valutazione dell’efficienza di trasfezione mediante valutazione dell’attività β- galattosidasica, dell’espressione dell’enzima mediante immunofluorescenza e allo studio dell’attività enzimatica.