A NALISI IMMUNOCITOCHIMICA

Le inclusioni si marcano per antigeni specifici dei corpi di Lewy come α- sinucleina e ubiquitina. L’α-sinucleina tende a disporsi ai margini del corpo incluso (Fig. 8a), mentre l’ubiquitina si colloca al centro in prossimità del core (Fig. 8b).

Ad ulteriore dimostrazione è stata eseguita una doppia marcatura con anticorpi anti α-sinucleina e anti ubiquitina con cui è stata confermata la localizzazione precedentemente descritta (Fig. 9).

a b

Figura 8: Immagini di immuno microscopia elettronica a trasmissione per la

localizzazione dell’α-sinucleina (a). La freccia indica l’immunomarcatura per l’ubiquitina (b) in un incluso che ingloba un mitocondrio.

Figura 9: Immagine al microscopio elettronico a trasmissione di marcatura

immunocitochimica: co-localizzazione di ubiquitina (punte di freccia, particelle di Au di 20 nm) e α-sinucleina (freccia, particelle di Au di 10 nm).

Gli inclusi presentano anche una immunomarcatura per il complesso catalitico 20S del proteasoma (Fig. 10), sistema deputato alla degradazione di proteine alterate. L’inibizione di tale sistema sembra rappresentare una tappa fondamentale nella catena di eventi che portano alla degenerazione selettiva di neuroni dopaminergici, come dimostrato in modelli sperimentali ottenuti con inibitori selettivi del sistema UP (Fornai et al., 2003).

a _b

Figura 10: Immunoelettromicroscopia per il complesso catalitico 20S del

5. A

Sono state eseguite analisi di immunoblotting per valutare una eventuale variazione di espressione dell’ubiquitina o dell’α-sinucleina nelle varie frazioni.

La banda osservata a 8 kDa è dovuta a monomeri di ubiquitina, mentre le altre, a pesi molecolari maggiori, si pensa siano da attribuire a catene di poliubiquitina, o comunque a molecole di ubiquitina coniugate con altre proteine (Fig. 18a). Dopo trattamento con MA in ogni frazione si osserva una diminuzione della quantità di ubiquitina libera rispetto al controllo (Fig. 11b), questo dato, integrato con i risultati ottenuti precedentemente dalle indagini di microscopia elettronica, suggerisce un accumulo di questa proteina all’interno degli inclusi.

C2 M2 C3 M3

a

Ci: cellule intere di controllo Mi: cellule intere trattate con MA C2: frazione nucleare di controllo M2: frazione nucleare da cellule trattate con MA

C3: frazione mitocondriale di controllo

M3: frazione mitocondriale da cellule trattate con MA

8 kDa

C2

M2

C3

Ci

Mi

M3

8 kDa

Figura 11a,b: Immunoblot per l’ubiquitina su PC12 intere e frazioni, trattate con

L’immunoblot per α-sinucleina mostra una riduzione della quantità di proteina nella frazione nucleare e nelle cellule intere rispetto al controllo. Invece, la frazione mitocondriale, che contiene il maggior numero di inclusi, mostra al contrario un incremento di α-sinucleina (Fig. 12).

Questi dati sono in linea con i risultati ottenuti dall’immunocitochimica che indicavano la presenza della proteina nelle inclusioni citoplasmatiche. Infatti, dopo trattamento con MA, l’α-sinucleina, normalmente presente nelle cellule, tende ad aggregarsi ed accumularsi all’interno degli inclusi, ed è quindi maggiormente presente nella frazione 3, dove questi sono più concentrati.

Ci

Mi

C2

M2

C3

M3

Figura 12 :Immunoblot per l’α-sinucleina su cellule e frazioni cellulari trattate con

MA 1µM per 72 ore e rispettivi controlli (C= controllo; M= trattato con MA; i= cellule intere; 2= frazione nucleare; 3= frazione mitocondriale).

DISCUSSIONE

I risultati di questo studio confermano la capacità della MA di indurre inclusioni citoplasmatiche in colture cellulari di PC12.

Le inclusioni ottenute presentano caratteristiche analoghe a quelle osservate

in vivo (Fornai et al., 2004) ed in colture di neuroni mesencefalici (Cubells et al., 1994) dopo trattamento con MA. Infatti all’analisi ultrastrutturale, si osservano le strutture multilamellari con un aspetto a spirale e la presenza di membrane che delimitano questi inclusi tipiche dei corpi autofagici.

L’aspetto degli inclusi varia in maniera tempo-dipendente come abbiamo evidenziato in questo studio con una progressione, attraverso forme intermedie, in inclusioni caratterizzate da core elettrondenso e dall’assenza degli strati membranosi. Questi probabilmente, fondendosi tra di loro, determinano una struttura molto compatta in cui non è più possibile distinguere le membrane. Tale struttura osservata bidimensionalmente per mezzo della TEM viene confermata, per la prima volta, dall’osservazione tridimensionale degli inclusi dopo macerazione osmica, preparazione che consente l’osservazione al microscopio elettronico a scansione degli organuli intracellulari.

Questo risultato è in linea con l’ipotesi che anche i corpi di Lewy possano maturare nel corso del tempo fino a raggiungere la loro conformazione classica, come descritto in studi post mortem effettuati su pazienti affetti da MdP (Gai et al., 2000).

Nel nostro studio si descrive inoltre come diversi tipi morfologici di inclusi si distribuiscano diversamente nelle frazioni cellulari. Il maggior numero di inclusioni

si osservano nella frazione mitocondriale, nella quale le inclusioni più rappresentate appartengono allo stadio 2, mentre le inclusioni di stadio 1 sono osservabili in numero maggiore nella frazione microsomiale e quelle di stadio 3 sia in quella nucleare che in quella microsomiale. Quest’ultimo dato fa ipotizzare che la progressiva perdita delle membrane provochi una compattazione che non è direttamente proporzionale ad una densità maggiore e che, pertanto, allo stadio 3 appartenga una popolazione eterogenea di inclusi con diversi gradi di densità e dimensioni. Questo suggerisce l’ipotesi che durante il processo di compattazione alcuni inclusi perdano del materiale e ciò li renda in qualche modo meno densi e quindi reperibili nella frazione microsomiale.

All’esame ultrastrutturale ed antigenico gli inclusi della frazione mitocondriale presentano un core che contiene residui mitocondriali e si marcano per l’α-sinucleina ma non per l’ubiquitina, in linea con i risultati ottenuti da Gomez-Tortosa e Collaboratori (Gomez-Tortosa et al., 2000) in pazienti parkinsoniani. Ad uno stadio più maturo, le inclusioni della frazione mitocondriale presentano una marcatura sia per l’ubiquitina che per l’α-sinucleina; inoltre, similmente a quanto accade nella MdP, l’immunomarcatura per i diversi antigeni ha una localizzazione differenziale essendo periferica per l’α-sinucleina e localizzata nel core centrale per l’ubiquitina.

I risultati che abbiamo ottenuto tramite indagini di immunoblotting hanno evidenziato che il pattern d’espressione dei monomeri di ubiquitina cambia nelle varie frazioni dopo trattamento con MA. La presenza di pesi molecolari variabili e multipli per l’ubiquitina fa supporre di avere nel nostro campione catene di poliubiquitina o proteine poliubiquitinate, che andrebbero a collocarsi proprio all’interno delle inclusioni di cui la frazione mitocondriale è particolarmente ricca.

Tra le possibili proteine poliubiquitinate c’è sicuramente l’α-sinucleina che, dall’analisi di immunoblotting, risulta particolarmente espressa proprio nella frazione mitocondriale.

Le proteine, una volta poliubiquitinate, vengono veicolate verso il proteasoma per la degradazione e i nostri dati di immonoelettromicroscopia hanno evidenziato che le inclusioni della frazione mitocondriale si marcano per il complesso 20S del proteasoma. Questo dato suggerisce che le inclusioni citoplasmatiche MA-dipendenti, presenti nelle PC12, possano essere il sito di accumulo di proteine come l’α-sinucleina, probabilmente alterata, quindi poliubiquitinata e veicolata verso il proteasoma per essere degradata.

Il ruolo del sistema UP nel processo di formazione delle inclusioni neuronali e nella fisiopatologia della MdP è confermato da numerose evidenze sperimentali e da studi genetici. Infatti, mutazioni di proteine che appartengono alla via UP o che sono specifici substrati dell’attività proteolitica di tale sistema risultano associate a varie forme ereditarie di MdP (Polymeropoulos et al., 1997; Kruger et al., 1998; Kitada et al., 1998; Zarranz et al., 2004), così come una significativa riduzione dell’attività del proteasoma è stata ritrovata nei neuroni nigrali residui di pazienti con MdP di tipo idiopatico (McNaught et al., 2002). Studi sperimentali hanno dimostrato che l’inibizione dell’attività del proteasoma provoca la degenerazione selettiva dei neuroni dopaminergici nigrali e la formazione di inclusioni neuronali. Questo effetto è stato osservato sia in seguito all’inibizione diretta del sistema UP, causata dall’utilizzo di inibitori specifici di una o più attività enzimatiche del proteasoma (McNaught et al., 2002; Fornai et al., 2004), sia in conseguenza di una riduzione dell’attività del sistema ottenuta indirettamente per mezzo della produzione di un eccesso di substrato (Fornai et al., 2004) o per carenza di ATP.

Tuttavia, anche altri sistemi proteolitici cellulari, come i lisosomi e i vacuoli autofagici sono coinvolti in alcune fasi del processo di formazione degli inclusi. Infatti, l’ubiquitina e proteine ubiquitinate sono state ritrovate all’interno di lisosomi e la formazione di autofagosomi è stata ipotizzata all’origine della formazione delle inclusioni osservate dopo trattamento con MA (Cubells et al., 1994). Anche la via lisosomiale sembra essere coinvolta nella formazione dei corpi inclusi, poiché in modelli sperimentali di MdP sono state ritrovate inclusioni nigrali α-synucleina positive anche in associazione a granuli di lipofuscina.

E’ stato infatti ipotizzato che l’aggregazione di α-sinucleina alterata possa interagire con le membrane mitocondriali provocando il danneggiamento della funzione mitocondriale stessa. Tale ipotesi trova conferma anche nel fatto che pazienti parkinsoniani hanno un’attività ridotta del complesso I della catena mitocondriale (Sherer et al., 2002).

Studi recenti hanno suggerito che i mitocondri potrebbero rappresentare potenziali bersagli subcellulari diretti della MA (Lemasters et al., 1999), tuttavia questo effetto, e la formazione delle inclusioni da esso derivante, potrebbe prevedere anche il coinvolgimento del sistema UP. Infatti, il reticolo endoplasmatico liscio (REL), in presenza di mitocondri alterati, potrebbe inglobare tali strutture e consentire al sistema UP, localizzato sulle membrane del reticolo, di svolgere la sua funzione di degradazione.

La struttura finale delle inclusioni MA-dipendenti suggerisce che alla base di tale fenomeno ci possa essere un processo multi-step, in cui un meccanismo iniziale scatena una risposta biologica che porta alla formazione degli inclusi.

E’ stato inoltre dimostrato che la tossicità della MA sui neuroni dopaminergici è mediata dallo stress ossidativo e dalla produzione di specie

reattive dell’ossigeno (ROS) (Fornai et al., 2004)le quali vengono aumentate dalla stessa DA endogena (Fornai et al., 2003; Fornai et al., 2004).

La produzione di stress ossidativo e di ROS sembra implicata anche nella formazione delle inclusioni intracellulari, probabilmente causando proprio un danno alle proteine cellulari, porterebbe ad un eccesso di proteine alterate che, a loro volta, potrebbero inibire per eccesso di substrato l’attività catalitica del sistema UP. Tra le proteine ritenute più vulnerabili all’azione dello stress ossidativo c’è proprio l’α-sinucleina (Cubells et al., 1994).

Inoltre, è stato recentemente dimostrato che abusatori di MA presentano inclusioni all’interno dei neuroni dopaminergici della substantia nigra. In presenza di uno stimolo tossico persistente sembra verificarsi un progressivo accumulo e segregazione delle proteine danneggiate in una porzione ristretta all’interno della cellula, e questo indurrebbe la precipitazione di aggregati proteinacei come inclusioni intracellulari (Fornai et al., 2004).

Pertanto sembra che l’effetto tossico indotto da accumulo di substrati, che in condizioni fisiologiche vengono degradati, porti ad una compromissione delle funzioni cellulari tale da indurre la morte della cellula stessa (Fornai et al., 2004).

Questa ipotesi è confermata dall’evidenza che i corpi di Lewy nigrali, nella MdP, sono presenti proprio in quei neuroni che sopravvivono alla neurodegenerazione.

In questo modo le inclusioni potrebbero essere considerate un meccanismo di difesa, che interviene quando sono presenti nelle cellule alti livelli di proteine alterate. L’intensità e/o la persistenza dello stimolo tossico sono fattori critici per far sì che la cellula evolva o verso la morte cellulare oppure che si inneschi il processo che porta alla formazione di inclusi.

Pertanto dal nostro studio possiamo concludere che: Le inclusioni osservate:

1) mostrano forti analogie con i corpi di Lewy;

2) sono immunopositivi per l’α-sinucleina e l’ubiquitina,

3) mostrano una maturazione progressiva tempo e dose dipendente, 4) gli inclusi presentano al loro interno il complesso 20S del proteasoma.

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