La citometria a flusso (FCM) è uno strumento unico per l’analisi di cellule ed elementi cellulari in sospensione liquida sulla base di una serie di parametri ottici, fisici e cromatici, consentendone la caratterizzazione e l’isolamento fisico in frazioni specifiche adatte a successive manipolazioni.
33 Le cellule sono analizzate in un periodo di tempo veramente breve (pochi microsecondi) durante i quali sono registrati una serie di segnali (parametri) come, ad esempio, la luce diffratta e le emissioni fluorescenti originate dalla particella stessa, che caratterizzano singolarmente gli elementi analizzati, uno alla volta. Le capacità dell’elettronica e la digitalizzazione del segnale rendono possibile una alta ―processività‖ di questo tipo di analisi, con ratei che si possono spingere sino ad analizzare effettivamente 104 elementi per secondo. Le particelle/cellule vengono quindi categorizzate sulla base di una matrice di valori, o parametri, e utilizzando queste analisi ―multiparametriche‖, è possibile individuare eventuali sottoinsiemi di ―popolazioni‖ presenti nel campione in analisi e, basandosi su queste differenze, separare fisicamente (flow sorting) queste popolazioni e caratterizzarle poi utilizzando tecniche analitiche sia cellulari che molecolari.
1.6.1 Come funziona un citometrio a flusso
I citometri a flusso sono strumenti complessi costituiti da tre parti principali: quella fluidica, quella ottica e quella elettronica. Quest’ultima è responsabile sia dell’acquisizione dei segnali che della loro elaborazione ed interfacciamento con l’operatore, e costituisce quindi la parte fondamentale che consente la gestione e l’uso della gran messe di dati prodotti dall’analisi multiparametrica.
La fluidica: Il sistema fluidico è responsabile del trasferimento ordinato del campione sperimentale dalla ―provetta‖ al punto di analisi dove vengono generati ―cellula per cellula‖ i segnali luminosi che forniscono le informazioni. Un fluido di convogliamento (sheath fluid) è responsabile del movimento del campione all’interno dello strumento, sino al suo allineamento ed incontro al punto di analisi dove viene intercettato. Mentre le particelle corrono nel flusso individualmente, esse vengono intercettate da una fonte luminosa (solitamente fornita di uno o più laser) in grado di generare segnali sia di fluorescenza che di luce diffratta (scatter). Fondamentale all’interno del sistema fluidico è la camera di flusso e l’orifizio tarato di uscita (nozzle), nella quale lo ―sheat fluid‖ (di norma una soluzione salina) pressurizzato, incontra il campione e lo comprime lateralmente allungando il flusso di liquido contenente le cellule stesse, grazie alla forza idrodinamica esercitata sul campione in sospensione; il risultato è la separazione e l’allineamento delle particelle in un flusso di singoli elementi, focalizzati, o confinati, al centro del flusso (Fig. 12). Questo fenomeno prende il nome di focalizzazione idrodinamica. Per ottenere ciò, lo scorrere dello sheat fluid
34 all’interno della camera non deve essere perturbato e le linee di forza devono scorrere parallele senza turbolenze formando un ―flusso laminare‖.
Figura 12. Schema esemplificativo di una camera di flusso.
L’ottica: I moderni citometri possiedono come sorgente di eccitazione uno o più laser, usualmente a stato solido, essenzialmente LED (light emitting diode) a specifiche emissioni. Altri laser con maggiori potenze e gestibili per la lunghezza d’onda della luce emessa, tipicamente laser a gas tipo argon, sono impiegati per applicazioni particolari e sono in grado di emettere fasci luminosi di potenza adeguata per tutte le applicazioni citofluorimetriche. Il fascio di luce emesso dal laser deve essere focalizzato in un punto specifico sul flusso di campione. Questo punto, detto ―interrogation point‖, è il luogo dove le particelle che corrono all’interno del flusso vengono analizzate ad una ad una. Come le particelle passano attraverso l’interrogation point, esse vengono eccitate dalla luce incidente, assorbono ed in parte diffraggono la luce di eccitazione ed emettono fluorescenza in ragione della loro struttura e della qualità del colorante associato. La luce diffratta in avanti (foward scatter) è raccolta da un sensore e convertita in impulsi di corrente. La luce diffusa ad angolo retto (side scatter) e la fluorescenza emessa dalle particelle sono raccolte da una lente posta a 90° rispetto al raggio di eccitazione (Fig. 13).
Il posizionamento di lenti di focalizzazione, specchi e filtri per la luce di lunghezza d’onda specifica, permette il rilevamento selettivo di questi segnali ottici (diffrazione e fluorescenza).
Campione Sheat fluid
Zona di focalizzazione idrodinamica
35 Il percorso ottico seguito dalla luce emessa dalle particelle analizzate deve essere accuratamente controllato, poiche’ ogni ambito di variabilita’ indipendente da quella biologica propria del campine stesso, deve essere ridotta al minimo possibile per consentire un’analisi accurata. La valutazione del corretto allineamento viene effettuata cercando di ottenere il minor coefficiente di variazione (CV) sul picco del segnale rappresentante le singole particelle. Il CV è un parametro adimensionale che rappresenta la deviazione standard come una percentuale della media (CV=SD/MediaX100), ed è una misura della deviazione dei valori del campione dal valore medio.
L’ elettronica: Grazie ai filtri presenti nello strumento i fotoni emessi da ogni particella analizzata sono separati in base al loro livello di energia (lunghezza d’onda) e diretti verso un appropriato ―detector‖. Questi sensori assorbono fotoni ed emettono elettroni, producendo quindi una corrente elettrica. La corrente prodotta è poi convertita in un segnale digitale riportato su un computer (Fig. 13). Nella maggior parte dei citometri abbiamo due principali tipi di sensori: fotodiodi e tubi fotomoltiplicatori.
Figura 13. Visione complessiva di un citometro a flusso. La luce di eccitazione del Laser (blu) viene raccolta dai sensori di diffrazione, mentre contemporaneamente le diverese emissioni fluorescenti vengono separate da filtri ottici specifici e convogliate ai sensori di fotoni (fotomultiplicatori) che generano segnali elettrici proporzionali alla quantita’ di fluorocromo presente.
36 Interfaccia informatica: Una volta digitalizzati i segnali sono mostrati o tramite istogrammi che indicano la frequenza di distribuzione del parametro selezionato, o con dot plots che mostrano la correlazione fra due parametri, dove ogni punto corrisponde ad un singolo evento analizzato dal citometro a flusso. Lo sviluppo dell’elettronica e dei programmi di gestione permettono così di collezionare un enorme numero di dati in un tempo brevissimo e renderli visibili in una forma grafica facilmente comprensibile.
1.6.2 La separazione cellulare (flow Sorting)
Il flow Sorting è la capacità che hanno alcuni citometri (flow sorter) di analizzare e separare fisicamente (sorting) le particelle di interesse in base alle loro proprietà ottiche. I flow sorter piu’ diffusi utilizano il principio del sorting elettrostatico, il quale si basa sulla capacità di discriminare la particella, determinare la sua posizione fisica nel flusso con un alto grado di accuratezza, rompere il flusso in goccioline con un cristallo piezoelettrico, mandare un impulso di carica sul flusso esattamente al momento giusto, cioè immediatamente prima che la goccia si distacchi dal flusso continuo (quando la cellula raggiunge l’ultima ―goccia‖ attaccata), separarla fisicamente tramite attrazione elettrostatica, e convogliare solo la goccia che contiene la particella di interesse dentro un contenitore predisposto (Fig. 14).
Figura 14. Principio base del processo di sorting. Le microgocce generate da un cristallo piezoelettrico che vibra a frequenza controllata, vengono caricate elltrostaticamente in base alla presenza o meno delle particelle di interesse. Un campo elettromagnetico stazionario induce la separzione delle gocce in base alla loro carica superficiale, separando cosi’ le cellule di interesse.
37 Per selezionare la nostra particella da separare basta semplicemente creare una finestra di sorting, ossia scegliere un intervallo di intensità di segnale su un istogramma di frequenza, come ad esempio un istogramma di intensità di fluorescenza o su un dot plot.
Il tasso di isolamento dipende da vari fattori, quali la velocità dell’analisi, la frequenza del tipo di particella da separare, il suo grado di risoluzione e la purezza richiesta. La purezza del sorting può essere valutata al microscopio a fluorescenza e tramite l’analisi del materiale separato ancora al citometro a flusso.