PARTE 1
Il primo obiettivo della presente tesi è stato quello di risolvere il problema dello scarso assorbimento della creatina a livello della BEE e delle membrane plasmatiche in condizioni di deficit del trasportatore o in altre condizioni patologiche in cui invece il trasportatore sia presente ma in cui vi sia la necessità di un passaggio più rapido ed efficace della creatina attraverso le membrane (caso dell’ictus ischemico). La creatina infatti attraversa scarsamente le membrane anche in presenza del trasportatore 76. A tal fine è quindi stata messa a punto la sintesi e la caratterizzazione di alcuni
profarmaci della creatina che possano riuscire ad attraversare la BEE e le membrane biologiche in un modo indipendente dalla presenza del trasportatore SLC6A8 e che una volta nello spazio intracellulare liberino la creatina come agente terapeutico. Tali composti sono stati progettati seguendo due diverse strategie.
1) La prima consiste nella modificazione dello scheletro della creatina in modo tale da renderlo più lipofilo e più stabile in mezzo fisiologico.
2) L’altra è quella di coniugare la creatina con molecole che utilizzino trasportatori alternativi all’SLC6A8.
Il primo approccio può essere seguito mediante l’aggiunta di gruppi funzionali apolari, che possano adiuvare il passaggio della creatina attraverso le membrane fosfolipidiche ma che anche possano essere poi facilmente rimossi da parte degli enzimi presenti nella cellula dopo l’internalizzazione del profarmaco al fine di ottenere creatina libera.
Precedentemente erano già state attuate modificazioni a livello del gruppo carbossilico della creatina. In particolare sono state realizzati due composti quali l’estere etilico e l’estere benzilico della creatina; l’estere benzilico in vitro ha mostrato di riuscire ad attraversare le membrane neuronali in fettine di ippocampo fornendo risultati positivi nei test biochimici aumentando in pratica la concentrazione di creatina e fosfocreatina intracellulari 110. L’estere etilico invece non ha mostrato
alcuna capacità di riuscire a passare le membrane plasmatiche in condizioni di trasportatore non funzionante 183. Entrambi i composti, tuttavia, si sono rivelati estremamente sensibili all’idrolisi del
legame estereo in fluidi biologici, ciclizzando a creatinina e limitandone quindi l’uso e l’applicazione
in vivo 110,183. È emersa quindi la necessità di modificare la molecola della creatina in altro modo; un
metodo fornito dalla farmacologia risulta essere l’aggiunta di gruppi acetilici alla molecola di partenza al fine di aumentarne la lipofilia e la stabilità in mezzo fisiologico; un esempio è la diacetil-morfina, o eroina, estremamente più lipofila della morfina stessa tanto da riuscire ad attraversare molto più facilmente e velocemente la BEE 173. L’aggiunta di gruppi acetilici è stata realizzata in questo caso
a livello di entrambi gli azoti del gruppo guanidinico della creatina, al fine di ottenere una molecola di creatina diacetilata. Tale modificazione renderebbe anche la molecola più stabile in mezzo fisiologico, impedendole la ciclizzazione a creatinina e prolungandone l’emivita 183.
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Durante la sintesi di tale molecola il reagente che introduce il gruppo carbossilico del derivato è un amminoacido esterificato con gruppo etile o terbutile, pertanto i prodotti risultano essere diacetilcreatina etilestere e terbutilestere. Tale molecola quindi avrebbe la funzione di profarmaco in grado di attraversare facilmente le membrane e una volta all’interno della cellula essere, grazie all’ azione di esterasi e amidasi, privato dei gruppi funzionali apolari, liberando la creatina. Il medesimo razionale è stato in seguito applicato ad una molecula precursore della creatina, l’acido guanidinoacetico, che nella biosintesi epatica della creatina risulta essere il precursore dell’ultima tappa la metilazione da parte della S-adenosil-metionina. Si è pertanto realizzata la sintesi dell’acido guanidinacetico diacetilato su entrambi gli atomi di azoto del gruppo guanidinico ed esterificato sul gruppo carbossilico. Le esterificazioni effettuate sono state di due tipi , volte ad ottenere sia l’estere metilico sia quello etilico.
L’altra strategia per ottenere derivati della creatina in grado di attraversare le membrane plasmatiche e la BEE è quella di coniugare la creatina con molecole che utilizzino trasportatori alternativi all’SLC6A8, in modo tale che essi possano fungere da carriers per condurre la creatina all’interno dello spazio intracellulare e “in loco” liberare la creatina stessa. Strategia già sfruttata per i trasportatori degli aminoacidi 189,190 e dell’acido ascorbico 203. In particolare a livello del SNC i
trasportatori del glucosio sono estremamente numerosi e ad alta efficienza 204, pertanto si è pensato
di utilizzare alcuni carboidrati da coniugare alla creatina in modo tale da ottenere un derivato che sfruttasse i trasportatori del glucosio per portare creatina all’interno delle cellule nervose.
Si suppone che solo i trasportatori del glucosio sodio-indipendenti siano responsabili del passaggio del glucosio e dei suoi analoghi (quali l’acido gluconico) attraverso la BEE e si ritiene che tali trasportatori non siano estremamente selettivi 205 . La coniugazione di creatina ad una molecola di
glucosio tramite un legame estereo si è rivelata estremamente labile data la facilità con cui si idrolizza l’estere; per ovviare a tale inconveniente si è quindi deciso di costituire un derivato della creatina dotato di un legame ammidico e quindi ritenuto più stabile all’idrolisi, coniugando la creatina con una molecola di glucosamina.
PARTE 2
Il secondo obiettivo di questa tesi riguarda un nuovo metodo di sintesi della fosfocreatina. Tutti i metodi pubblicati finora utilizzano come agente guanilante un composto recante un gruppo fosfato protetto da gruppi benzilici o fenilici e portano ad un prodotto ottenuto in bassa resa e con molti sottoprodotti; la bassa resa probabilmente è dovuta ad una scarsa reattività dell’agente guanilante utilizzato, quando esso è costituito da un derivato della cianoammide. Per aumentare la reattività dell’agente guanilante utilizzato, nel laboratorio in cui è stato svolto questo lavoro di tesi si è deciso di utilizzare un agente guanilante recante un gruppo protettivo ed in particolare il gruppo tert -butossi carbonilico (t-Boc) che si è rivelato essere il più appropriato oltre ad aumentare notevolmente la solubilità della molecola nei solventi organici. Come agente guanilante è stato utilizzato la S-
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metilisotiourea, cui è stato aggiunto un gruppo protettore t-Boc su uno dei due atomi di azoto guanidinici; in seguito è stato fosforilato l’agente guanilante con un agente fosforilante recante due gruppi benzilici come gruppi protettori ed infine la molecola è stata coniugata con l’ammina secondaria sarcosina etilestere, per ottenere l’estere etilico della fosfocreatina. Tali metodiche sintetiche sono modificazioni mirate di metodi utilizzati già nel laboratorio in cui è stato svolto questo lavoro di tesi per sintetizzare derivati della creatina. L’idrolisi dell’estere ha permesso l’ottenimento di un prodotto in buona resa.