funzionalità cardiaca: il ββββ 3-AR
3.3 Pathway trasduzionale attivato dal ββββ 3-AR
In ventricoli umani, il lusitropismo negativo β3-AR-indotto dipende dalla produzione di NO mediata dalla isoforma endoteliale costitutivamente espressa della NO sintasi (eNOS) e dal conseguente incremento delle concentrazioni intracellulari di cGMP (Gauthier et al., 1998; Varghese et al., 2000). In accordo con questa interazione β3AR-NO, il presente lavoro ha evidenziato che il lusitropismo negativo indotto dal BRL37344 risulta mediato dal sistema NO- cGMP-PKG. Il coinvolgimento di questo pathway nella risposta lusitropica negativa β3-adrenergica non era stato mai esplorato finora. Sebbene sia molto dibattuto il ruolo assunto dallo NO nel rilassamento miocardico, soprattutto in relazione alle condizioni sperimentali (quali cuori non stimolati o β-AR stimolati; concentrazioni di NO, dipendenza temporale; Massion & Balligand, 2003; Seddon et al., 2007), è certo che lo NO, attraverso produzione di cGMP, influenza il rilassamento miocardico attraverso riduzione della sensibilità dei miofilamenti al Ca2+, causando una riduzione del tono diastolico, un anticipato inizio del rilassamento isotonico con un piccolo effetto sugli indici della contrazione. Questo effetto, essendo negativamente modulato dal KT5823, induce la fosforilazione della TnI mediante attivazione dalla PKG (Shah et al., 1995; Seddon et al., 2007 e referenze successive). Recentemente, è stato ipotizzato un ruolo per lo NO prodotto dalla isoforma neuronale della NOS (nNOS) nel controllo del rilassamento miocardico sia in condizioni basali che in seguito a stimolazione adrenergica. La specifica localizzazione della nNOS sullo SR e/o sul sarcolemma suggerisce che esso possa modulare diverse molecole (SERCA2A, PLB, recettore per la rianodina, Ca2+ ATPasi sarcolemmali e i canali di tipo L) coinvolte nella regolazione del Ca2+, così da
influenzare il rilassamento miocardico (Ashley et al., 2002; Zhang et al., 2007).
I risultati ottenuti dimostrano anche che il lusitropismo negativo β3- AR mediato non risulta modificato in presenza di inibizione della pCG mediante pretrattamento con uno specifico antagonista, l’anantina. In accordo con ciò, la cascata attivata dal β3-AR converge solo sulla sGC, escludendo così la possibilità di una seconda fonte di produzione del cGMP. Questo suggerisce una modulazione lusitropica dell’attività cardiaca spazialmente organizzata e che rende conto della risposta miocardica all’attivazione del β3-AR.
Conclusioni
I risultati ottenuti in questo lavoro di tesi confermano l’ipotesi secondo cui la rCga1-64, prodotta dal cuore, e il 17β-estradiolo, un fattore esclusivamente endocrino, agiscono quali importanti regolatori omeostatici del sistema cardiovascolare. In particolare, entrambi gli ormoni sono capaci di attivare il sistema NOS/NO, importante crocevia di molti pathways intrinseci ed estrinseci coinvolti nella fine regolazione dell’attività cardiaca (es. il sistema β3-adrenergico).
L’analisi dell’effetto cardiotropo del frammento rCga1-64 ha permesso di caratterizzare l’influenza che in modo autocrino/paracrino questo peptide esercita sul cuore di ratto. La proteina progenitrice della rCga1-64 (la Cga) è rilasciata in situazioni di stress insieme alle catecolamine, ma anche in condizioni di scompenso cardiaco cronico per cui i suoi frammenti peptidici potrebbero contribuire a mantenere la funzionalità cardiaca in condizioni patologiche, quali l’ischemia-riperfusione, come evidenziato in recenti studi riguardo l’efficace azione protettiva operata dal frammento umano N-terminale1-78, hrVS-1 (Cappello et al., 2007).
Al contempo è stato dimostrato che l’effetto inotropo negativo indotto dal 17β-E2 sul cuore di ratto maschio richiede l’attivazione del nuovo recettore di membrane GPR30 oltre ai classici recettori estrogenici ERα e ERβ. Questo lascia ipotizzare un possibile cross- talk funzionale tra i diversi sottotipi recettoriali la cui attivazione comporta il coinvolgimento di ERK, PI3K, PKA con conseguente attivazione della eNOS. Anche l’attivazione di GPR30 comporta reclutamento della eNOS, suggerendo che la produzione di NO giochi
un ruolo cruciale nella risposta del cuore di ratto maschio alla stimolazione estrogenica.
I dati ottenuti ulteriormente confermano che il sistema NOS/NO rappresenta un vero e proprio trasduttore-segnalatore integrato il quale, per la sua organizzazione spaziale e temporale, può essere considerato un regolatore chiave della funzionalità cardiaca. Questo risulta particolarmente importante in situazioni di intensa stimolazione adrenergica (es. sindrome da stress), responsabili di un forte aumento dell’attività cardiaca. A tal proposito, è da sottolineare che tanto la rCga1-64 che il 17βE2 possano esercitare il loro tono inibitorio e la loro azione antiadrenergica modulando direttamente o indirettamente il sistema β3-adrenergico cardiaco, contrastando così gli effetti delle catecolamine. Al centro dei meccanismi di regolazione attivati dalle due sostanze umorali, un ruolo di primo piano è svolto dalla cascata trasduzionale NOS/NO/cGMP/PKG. Nel caso della modulazione adrenergica inibitoria cardiaca β3-mediata, lo NO agirebbe quale “beta-bloccante endogeno”.
Il fitto intreccio trasduzionale potrebbe realizzarsi secondo uno specifico profilo spazio-temporale, ad esempio all’interno delle caveolae dove sono co-localizzati importanti effettori del segnale tra cui i β3AR, ERs, GPR30, eNOS e dove convergono molti segnali inter- e intra-cellulari atti a modulare la produzione di NO sia in condizioni fisiologiche che patologiche quali l’iperstimolazione cardiaca in cui è richiesta una riduzione della performance cardiaca o in condizioni di ischemia-riperfusione dove una modulazione negativa dell’attività cardiaca limita i danni da riperfusione.
In questo contesto, il sistema NOS/NO rappresenta un importante regolatore omeostatico atto a mantenere la condizione di “Zero steady state error homeostasis” in cui assumono una rilevanza fondamentale sia tutte quelle variabili legate al genere (Sun et al.,
2006), sia la localizzazione delle NOS e il sito di produzione dello NO (Barouch et al., 2002; Ziolo & Bers, 2003; Katori et al., 2006; Walsh et al., 2004), sia l’attivazione di pathways trasduzionali cGMP- dipendenti e cGMP-indipendenti che hanno come targets distinti elementi delle proteine contrattili, sia l’effetto ormesico NO-indotto (Mendelson et al., 2003), che le specie prodotte (Kohr et al., 2008; Ziolo et al., 2001; Tocchetti et al., 2007) e lo stato contrattile dei cardiomociti (Ziolo et al., 2001; Tocchetti et al., 2007; Kojda et al., 1996; Kohr et al., 2008). Nel complesso, questi dati aggiungono nuova luce sulla funzione endocrina del cuore, in cui il segnale NO- mediato, pur molto complesso, rappresenta un modulatore centrale convergente in molteplici funzioni cruciali per la regolazione della funzionalità cardiaca in condizioni fisiologiche che patologiche.