Peptide GISL 006: sequenza primaria SLMA8ESSMQ

Evidentemente il peptide era rimasto adesso alla fase stazionaria e, unicamente nel lavaggio finale, è stato rilasciato. Proprio per queste ragioni è sempre bene procedere alla raccolta durante questa fase; talvolta, infatti, ciò che si desidera ottenere dalla purificazione può rimanere nei prodotti di scarto e senza una corretta raccolta di questi si perde il lavoro di parecchi giorni di sintesi.

Fig. 40 Cromatogramma HPLC pep. GISL 006

Analisi UPLC:

L’analisi UPLC riportata in figura 41 è stata effettuata per un tempo di 20 nuti, al contrario di quelle precedenti che hanno avuto una durata di soli 6 mi-nuti. Il motivo è stato che il peptide risultava maggiormente idrofobo rispetto a quelli precedenti, dunque è stato necessario utilizzare un maggior quantitativo di fase mobile e per un periodo di tempo maggiore.

4.7 GISL 007: sequenza primaria RGILESLMA8ES La struttura fa riferimento alla sequenza

hTHSR 292-300.

La struttura terziaria ottenuta mediante utilizzo del software PEP3FOLD è ripor-tata a fianco.

Fig. 41 AnalisiUPLC GISL 006.

Fig. 42 Struttura terziaria GISL 007.

L’analisi HPLC ed analisi CAD del peptide 007 sono riportate in figura 43 e fi-gura 44, rispettivamente.

Fig. 43 Cromatogramma HPLC pep. GISL 007

Fig. 44 Analisi CAD pep GISL 007

4.8 GISL 008: sequenza primaria MA8ESSMQ

La struttura del peptide in oggetto è stata realizzata a partire dallo studio della sequenza 306-318 del hTSHR¹⁷; la struttura terziaria riportata di seguito è stata realizzata mediante l’utilizzo del software PEP3FOLD.

Analisi HPLC:

Come si può notare dallo spettro riportato in figura 46, il prodotto della mia sintesi non è risultato immediatamente puro. Sono emersi diversi picchi che hanno portato all’analisi di più pool di frazioni. In questo caso, dato che è stato complesso identificare mediante analisi UPLC e LC-MS dove si trovasse il pep-tide, ho eseguito nuovamente un’ulteriore purificazione HPLC.

La successiva analisi CAD del peptide 008 è infine riportata in figura 47.

17 hTSHR: Human TSHR.

Fig. 45 Struttura terziaria pep. GISL 008.

Fig. 46 Cromatogramma HPLC del pep. GISL 008.

Fig. 47 Analisi CAD pep. GISL 008

4.9 GISL 009: Struttura primaria SLMC8ESSM.

La struttura primaria è stata studiata in corrispondenza della sequenza prima-ria del hTSHR 255-270. La struttura terziaprima-ria è stata studiata mediante l’utilizzo del software PEP3FOLD ed è riportata di seguito.

Analisi CAD:

Come si evince dal grafico riportato in figura 49, durante l’esecuzione del pro-cesso di quantificazione mediante metodica CAD è emerso che nel mio prepa-rato finale ci fossero in realtà due composti. Questo mi ha portato a sintetizzare nuovamente il prodotto e procedere successivamente con tutte le fasi succes-sive di purificazione.

Fig.48 Struttura terziaria pep.

GISL 009.

4.10 GISL 010: sequenza primaria RGILESLMC8ES.

Questa struttura è stata creata a partire dalla sequenza primaria del hTSHR 292-300. La struttura terziaria è stata stu-diata mediante l’uso del software PEP3FOLD ed è riportata a fianco in fi-gura 50.

Fig. 49 Analisi CAD pep. GISL 009

Fig. 50 Struttura terziaria pep. GISL 010.

I cromatogrammi relativi alle analisi HPLC e CAD del peptide 010 sono riportati in figura 51 e figura 52, rispettivamente. Come si può notare dal cromato-gramma HPLC è stato molto difficile individuare la frazione corretta contenente il peptide di interesse.

Fig. 51 Cromatogramma HPLC pep GISL 010

Fig. 52 Analisi CAD pep. GISL 010

4.11 GISL 11: sequenza primaria MC8ESSMQSLRQ

Il peptide è stato progettato a partire dalla sequenza 306-318 del hTSHR.

La struttura terziaria condotta mediante analisi PEP3FOLD e riportata di se-guito. Il peptide in oggetto non si è rivelato di particolare interesse.

4.12 GISL 12: sequenza primaria KKKAFLGSLRQ

Si tratta di un peptide scrambled che è stato realizzato, come spiegato prece-dentemente, per l’esecuzione di test ELISA di

con-trollo. La sua struttura terziaria riportata in fu-gura 54 è stata anch’essa realizzata utilizzando il software PEP3FOLD.

Essendo un peptide scrambled il grado di purezza di quest’ultimo non era necessario fosse estrema-mente elevato in quanto, ciò che a noi interessava,

era che non reagisse con gli anticorpi che si trovano nel siero dei pazienti GD.

Fig. 53 Struttura terziaria GISL 011.

Fig. 54 struttura terziaria GISL 012.

Analisi HPLC:

Dalla lettura del cromatogramma riportato in figura 55, emergono due diversi picchi a due tempi differenti: in questo caso il prodotto va ricercato sempre nelle frazioni in corrispondenza del picco al minuto 8. Tuttavia, per maggiore sicurezza è stato necessario condurre delle analisi di verifica, quali LC-MS, an-che sulle frazioni 39-42.

Fig. 55 Cromatogramma HPLC del pep. GISL 012.

Analisi CAD:

Come emerge dal cromatogramma riportato in fugura 56, nel mio preparato fi-nale si trovano ben 3 prodotti, dei quali in particolare il prodotto X (che corri-sponde al peptide) risulta essere l’unico valido. Gli altri prodotti che sono stati riscontrati sono impurezze che non sono state eliminate in maniera opportuna nelle fasi precedenti, ma come riportato sopra, la purezza di questo prodotto non è realmente rilevante ai fini dell’esecuzione del test ELISA.

Fig. 56 Analisi CAD GISL 012.

4.13 GISL 013: sequenza primaria MCLESGTKLDAGILE

Si tratta nuovamente di un peptide scrambled, ossia la sua sequenza primaria non fa riferimento ad alcuna sequenza reale del hTSHR, ma è stata realizzata a caso. La sua struttura terziaria condotta utilizzando il software PEP3FOLD è ri-portata di seguito.

Fig 57 Struttura terziaria pep.

GISL 013.

I.II - Indice esplicativo delle sequenze amminoacidiche.

8= residuo di lisina (LYS).

http://130.88.97.239/bioactivity/aacodefrm.html

I.III. Test ELISA

La seconda ed ultima parte del mio progetto di tesi è stato focalizzata sull’uti-lizzo dei peptidi, precedentemente sviluppati, al fine di eseguire su di essi test ELISA che dimostrassero l’effettivo riconoscimento da parte degli anticorpi presenti nel siero dei pazienti Graves ed il livello di reattività con quest’ultimi.

Il siero dei pazienti è stato raccolto in seguito ad approvazione da parte del co-mitato etico dell’ospedale Rigshospitalet, di Copenhagen.

Per l’esecuzione di test di controllo sono stati impiegati i sieri di pazienti sani (Healthy control patients); siero proveniente da pazienti diabetici (Diabetes Type I, TD); siero di pazienti con Lichen Sclerosus (LS) e pazienti con Artrite Giovanile Idiopatica (Juvenile Idiopathic Arthritis -JIA).

I dati ottenuti purtroppo non sono divulgabili in quanto il progetto è stato rea-lizzato per conto dell’azienda Novo Nordisk A/L ed è coperto da brevetto per lo sviluppo di un test diagnostico. Tuttavia, posso sicuramente affermare, in ma-niera molto generica, che i risultati dei test ELISA si sono dimostrati molto pro-mettenti per la realizzazione del nuovo metodo diagnostico.

I.IV Disegno sperimentale per l’esecuzione dei test ELISA.

Per prima cosa sono stati effettuati dei test pilota per stabilire quale fosse la corretta e più efficace esecuzione dei test biologici successivi. I test pilota sono stati eseguiti su un totale di 16 piatti ELISA. Sono stati impiegati cinque peptidi (GISL 001, GISL 003, GISL 006, GISL 007, GISL 008) ed il siero di tre diversi

gruppi di pazienti: Healthy controls (Pazienti sani), pazienti con diabete milito di tipo I e, infine, pazienti con Morbo di Graves. A questi sono stati applicati 4 diversi gradi di diluizione in modo da individuare quello ottimale per far rica-dere i valori di assorbanza in un range adeguato della curva di calibrazione:

1:40, 1:80; 1:100; 1:120. I risultati di questi test pilota hanno condotto alla con-clusione che la diluizione migliore fosse la 1:100 e perciò quest’ultima è stata quella impiegata anche nelle analisi successive. In figura 58 è riportato uno schema rappresentativo di come sono stati svolti gli esperimenti ed organizzati i campioni nelle varie piastre ELISA.

Come si può notare dallo schema riprodotto in figura 58, sono riportate sche-maticamente le piastre nel caso di utilizzo del siero di pazienti Graves (GD) e diabetici (TD). Ho impiegato i peptidi 001, 003, 006, 007 e 008. Ciascun peptide è stato testato in duplicato.

Nelle due colonne terminali (B, blank wells) non è stato effettuato alcun coating con peptidi. Solitamente è buona norma lasciare le ultime due colonne di un piatto ELISA prive del campione ricercato, questo perché in questo modo si rie-sce a determinare il contributo di qualsiasi tipo di variazione causato da fattori aspecifici della piastra stessa durante la misurazione della densità ottica (OD, optical density). È desiderabile ottenere dei risultati di questi pozzetti molto bassi, vicino il più possibile allo zero. Se ciò avviene vuol dire che è stata realiz-zata una buona strategia ELISA e tutti gli steps, quali la fase di coating, i lavaggi e l’aggiunta di blocking agent sono stati eseguiti correttamente.

In figura 59 ho riportato una schematizzazione della struttura di un piatto ELISA impiegato per il test su siero dei pazienti sani (Healthy controllo, H).

Fig. 59 Esempio schematico di piastra ELISA impiegata per i test su siero di pazienti sani (Healthy controls).