Permeazione transmucosa di Nanoparticelle di Argento

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e Robinson J. 1988), poiché le dimensioni delle cellule crescono e la loro forma si appiattisce passando dallo strato basale a quello superficiale.

Da quando la nanotecnologia si è diffusa ed è aumentato l’uso di elementi in forma nanoparticellare in molti settori della vita quotidiana, solamente pochi studi hanno valutato la possibile differenza nei profili di permeazione fra nanoparticelle e omologhe sostanze in forma macromolecolare attraverso la membrana mucosa, inoltre non è chiaro se le nanoparticelle possono essere rischiose per la salute e la sicurezza umana o se, al contrario, possano essere sfruttate come nano-carriers per migliorare la somministrazione di farmaci (Teubl 2012, Roblegg 2011).

Gli studi presenti in letteratura hanno indagato la penetrazione di NPs di polistirene, con risultati controversi. Olmsted e colleghi (2001) hanno dimostrato che nanoparticelle neutre del diametro di 59 nm vengono completamente immobilizzate a livello del muco della cervice, mentre secondo Teubl e collaboratori (2012) nanoparticelle delle dimensioni di 25 nm, 50 nm and 200 nm possono oltrepassare il film di muco e penetrare nella mucosa buccale in modo direttamente proporzionale alle loro dimensioni, contrariamente a quanto si potrebbe ipotizzare.

Poiché le caratteristiche di penetrazione attraverso la mucosa orale non sono ancora del tutto note abbiamo progettato uno studio al fine di verificare la capacità delle AgNPs di oltrepassare tale barriera e di essere così disponibili per l’assorbimento sistemico. Abbiamo scelto di utilizzare la mucosa buccale perché si ritiene che sia quella maggiormente implicata nell’assorbimento a livello del cavo orale e le AgNPs poiché, grazie alle note proprietà antibatteriche, sono comunemente utilizzate in molti devices che possono entrare in contatto con la mucosa orale.

59 Materiali e metodi

Sono stati condotti degli esperimenti di permeazione transmucosa in vitro. Sono state create due differenti soluzioni donatrici ed applicate separatamente sulla superficie esterna della mucosa di due gruppi di 4 celle ciascuno. La prima era una sospensione di AgNPs alla concentrazione di 500 mg/L (Esp. 1), mentre la seconda era una soluzione ottenuta dall’ultrafiltrazione della prima (filtri Amicon Ultra-4, 10KDa MWCO) e contenente solo ioni Ag (Esp.2). Le AgNPs utilizzate (core di argento: 25%, rivestimento in polivinirropirolidone:

75%) avevano dimensioni pari a 19 ± 5 nm (media e deviazione standard). Gli esperimenti sono stati condotti per un totale di 4 ore (Robbleg, Frolig 2012). Ogni esperimento è stato ripetuto due volte per un totale di 8 celle, con 64 analisi del contenuto di argento nelle celle riceventi e 7 analisi delle membrane mucose. Alcuni campioni di mucosa sono stati anche fissato in glutaraldeide al 10%, per le analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM-EDX). Le NPs utilizzate sono state caratterizzate tramite microscopio elettronico a trasmissione TEM, tecnica DLS e del potenziale Z. L’analisi dei dati è stata condotta tramite Excel per Windows 2007 ed il Software Stata, versione 11.0 (StataCorp LP, College Station, TX, USA). Tutti i dati sono stati riportati come media ± deviazione standard (DS). La differenza fra campioni indipendenti è stata testata con test di Mann-Whitney. Come limite di significatività statistica si è scelto un valore di p <0.05.

Risultati

Le analisi al TEM hanno rivelato che le AgNPs usate nella soluzione donatrice erano della dimensione pari a 19 ± 5 nm e uniformi in dimensione e forma (numero di nanoparticelle analizzate = 100) ed alla concentrazione utilizzata non sono stati visualizzati aggregati.

L’analisi quantitativa delle aliquote ultrafiltrate ha rivelato che il 5% della soluzione donatrice si poteva considerare ionizzata (o quantomeno in una forma capace di attraversale i filtri di 10 KDa): questo significa che come fase donatrice nell’esperimento 2 è stata utilizzata una dose pari a 3.8 μg cm^-2. L’analisi delle dimensioni delle nanoparticelle ottenuta tramite analisi DLS

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mostrava una curva di distribuzione abbastanza stretta, elemento che depone per una buona omogeneità delle NPs utilizzate. Il diametro medio delle NPs risultava pari a 57.10 nm, con una dispersione, indicata come indice di polidispersione (PdI= polidispersity index), pari a 0.28. Tale dato, definito come diametro idrodinamico, ed apparentemente discrepante rispetto a quello ottenuto con l’analisi TEM, tiene in considerazione anche lo spessore del rivestimento delle nanoparticelle in polivinilpirrolidone, e risulta pertanto maggiore. È stato dimostrato un flusso di permeazione attraverso la mucosa ed il trend delle concentrazioni di argento nelle fasi riceventi era crescente in funzione del tempo, con valori finali similari nelle celle esposte ad AgNPs e alla soluzione ultrafiltrata (12.2 ± 7.4 ng cm^-2 h^-1 e 11.8 ± 11.1 ng cm^-2 h^-1, rispettiavemente). Anche i valori dei flussi di permeazione ed i lag times, sono risultati similari alla quarta ora di esperimento nelle celle esposte ad AgNPs e alla soluzione ultrafiltrata (flussi: 6.8 ± 4.5 ng cm^-2 h^-1 e 5.2 ± 4.3 ng cm^-2 h^-1 rispettivamente, lag times: 1.9

± 0.7 h e 1.7 ± 0.7 h). La concentrazione di argento nella mucosa ha mostrato valori similari in entrambi gli esperimenti (1.6 ± 2.0 µg/cm² nella mucosa esposta ad AgNPs e 1.2 ± 0.8 µg/cm² alla soluzione ultrafiltrata). Le indagini SEM-EDX non hanno mostrato tracce di cluster di AgNPs nei tessuti. L’analisi SEM ha rivelato la presenza di zone elettrondense al di sopra del tessuto mucoso esposto ad AgNPs, ma l’analisi specifica delle zone elettrondense ha dimostrato l’assenza di argento o particelle di cloruro di argento.

Discussione e conclusioni:

La mucosa orale è stata largamente indagata come possibile via di assorbimento sistemico per farmaci, ma pochi sono gli studi che hanno approfondito il suo ruolo nei confronti dell’assorbimento di sostanze in forma nanoparticellare. Se da un lato la mucosa orale agisce come prima barriera nei confronti di xenobiotici e patogeni, dall’altro si pone come porta d’ingresso alla circolazione sistemica per le sostanze che riescono a penetrarla. Pochi studi sono stati condotti per misurare la permeabilità della mucosa nei confronti delle nano

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particelle, e la maggior parte di questi si è concentrato sull’analisi di nanoparticelle di polistirene, giungendo a risultati discordanti.

Olmsted e colleghi hanno dimostrato che microsfere di polistirene (del diametro di 59-1000 nm) sono completamente immobilizzate nello strato di muco della cervice uterina e non possono penetrare la mucosa, mentre Holpuch e collaboratori hanno dimostrato che nanoparticelle di polistirene delle dimensioni di 210 nm possono oltrepassare l’epitelio integro della mucosa umana e possono essere riscontrate a livello del tessuto connettivo sottostante, dimostrando quindi la capacità delle NPs di penetrare la membrana basale.

Robblegg e colleghi hanno investigato il comportamento delle NPs attraverso la membrana mucosa orale effettuando una serie di esperimenti con NP di diverse dimensioni e con diversa carica superficiale e utilizzando membrane mucose a diversa temperatura. Questo gruppo ha dimostrato che NPs di polistirene (PP) a carica neutra delle dimensioni di 25, 50 e 200 nm possono tutte attraversare la mucosa, sorprendentemente in modo direttamente proporzionale alle loro dimensioni. NPs a carica positiva, delle dimensioni di 200 nm possono anch’esse attraversare la membrana mucosa, mentre NPs delle stesse dimensioni ma cariche negativamente aggregano e vengono immobilizzate nello strato mucoso e solamente quelle di grandezza pari a 20 nm possono passare. Inoltre è stato dimostrato che anche la concentrazione di NPs gioca un ruolo nell’uptake orale, poiché aumentando la loro concentrazione (50-100-200 µg/ml) l’assorbimento decresce, dato probabilmente attribuibile alla formazione di aggregati. Questo studio aveva lo scopo di indagare le capacità di permeazione di AgNPs attraverso la mucosa orale suina mediante l’utilizzo delle celle di diffusione statica di Franz. I risultati hanno evidenziato, per la prima volta, che le AgNPs possono favorire l’assorbimento di argento attraverso la mucosa del cavo orale in una quantità analoga a quella ottenuta utilizzando argento in forma ionizzata. Si può pertanto affermare che la maggior quantità di argento assorbito è determinata dalla forma ionizzata del metallo.

Un’ulteriore supporto a questa ipotesi è fornito dai risultati delle indagini al SEM, che non

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identificano la presenza di cluster di AgNPs nel tessuto, mentre dalle analisi quantitative viene garantita la presenza del metallo nel tessuto mineralizzato. Si sottolinea che il nostro studio ha indagato esclusivamente l’assorbimento di AgNPs attraverso la mucosa orale integra, ma nella vita quotidiana ci sono circostanze comuni che possono condurre ad un’alterazione della sua integrità, quali ad esempio la presenza di reflusso gastroesofageo, di infezioni e di abrasioni accidentali che nel complesso potrebbero comportare un incremento dell’uptake mucoso.

Per la bibliografia completa si faccia riferimento all’Allegato I

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4.6 Studio pilota sulla permeazione transmeningea di nanoparticelle di Argento