Il PI-103 Sinergizza con la Vincristina

Precedenti studi hanno messo in evidenza come l’attivazione di mTOR possa conferire chemioresistenza ai farmaci che hanno come bersaglio i microtubuli, come gli alcaloidi della Vinca (Vinblastina, Vincristina). Le linee cellulari di LAL-T CEM-S, Jurkat e Molt-4 sono state incubate per 24 h ore o con PI-103 da solo, o con Vincristina da sola, o con entrambi i farmaci in combinazione in un rapporto costante. Il trattamento combinato è risultato significativamente più citotossico, con valori di Combination Index minori di 0.3, rispetto ai singoli trattamenti (Figura 4.14).

Figura 4.14. La combinazione di PI-103 e Vincristina è sinergica in cellule MOLT-4, JURKAT, and CEM-S. A: saggio MTT in presenza di Vincristina (VCR) e PI-103 somministrati singolarmente, o in

combinazione in rapporto costante (1:25). B: I valori di combination index (CI) sono stati ottenuti tramite il software di analisi per gli effetti combinati Calcusyn.

4.2.5. I blasti leucemici di pazienti pediatrici affetti da LAL-T sono sensibili al trattamento con PI-103

L’effetto del PI-103 su blasti leucemici di pazienti pediatrici affetti da LAL-T, isolati dal midollo osseo o dal sangue periferico, è stato valutato tramite un saggio di citotossicità MTT.

I pazienti avevano mostrato attivazione dell’asse di PI3K/AKT/mTOR, valutata attraverso analisi fenotipica dei blasti per la Ser473 di Akt e la Thr37/46 di 4E-BP1 (Figura 4.15). Tutti i pazienti (7/7) avevano mostrato un’ espressione di pAKT e p4E-BP1 più alta rispetto ai donatori sani. Trattando i blasti con PI-103, si è ottenuta una riduzione dei livelli di fosforilazione di AKT ed un’attivazione della caspasi 3 maggiori rispetto al trattamento con Rapamicina (Figura 4.15).

I blasti sono stati inoltre trattati con dosi crescenti di PI-103 per 96 h al fine di valutare l’attività citotossica del farmaco. Dall’analisi effettuata è emerso che il PI-103 è stato capace di indurre una forte riduzione della attività metabolica, con un IC50 compresa tra 0.18-0.63 μM.

Risultati

49

Figura 4.15. Il PI-103 induce citotossicità in blasti leucemici di pazienti pediatrici affetti da LAL-T, con fosforilazione costitutiva di AKT e 4E-BP1 e induce attivazione della caspasi-3. A: analisi citofluorimetrica di campioni di LAL-T per I livelli di fosforilazione di Ser473 p-Akt and Thr 37/46 p-4E-BP1. Quattro pazienti rappresentativi sono mostrati. B: analisi citofluorimetrica di campioni di LAL-T per i livelli di fosforilazione di Ser473 p-Akt, in seguito a trattamento con PI-103 (0.5 µM for 72 h). C: analisi citofluorimetrica dell’attivazione della caspasi-3 in campioni di LAL-T trattati con Rapamicina (0.1 µM) o PI- 103 (0.5 µM) per 72h. D: saggio MTT su blasti trattati con PI-103 a concentrazioni crescenti per 96 h. I risultati sono la media di 2 esperimenti indipendenti ± SD. L’asterisco indica una differenza statisticamente significativa (p<0.001) rispetto alle cellule non trattate. Quattro pazienti rappresentativi sono mostrati.

4.3. Doppia inibizione di PI3K/mTOR: NVP-BEZ235

4.3.1.L’NVP-BEZ235 doppio inibitore di PI3K/mTOR ha un effetto proapoptotico e induce un accumulo nella fase G0/G1 del ciclo cellulare in cellule di leucemia linfoblastica acuta T (LAL-T)

L’effetto del doppio inibitore di PI3K/mTOR NVP-BEZ235 è stato testato su sei linee cellulari di LAL-T che mostravano attivazione dell’asse di sopravvivenza. Le cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti del farmaco e dopo 24 h di trattamento è stato analizzato l’effetto citotossico. Analisi attraverso saggi MTT hanno mostrato che il farmaco era in grado di diminuire la proliferazione in modo significativo in tutte le linee analizzate con un IC50 da 150 a 300 nM. Le BE-

mTORC1, hanno un IC50 maggiore. Un confronto fra PI-103 ed NVP-BEZ235 ha dimostrato come

quest’ultimo sia stato significativamente più efficace nel causare citotossicità quando utilizzato a concentrazioni equimolari (Figura 4.16 B)

Attraverso l’analisi con Annessina V-FITC e PI, è stato valutato se la diminuzione della proliferazione fosse correlata all’apoptosi. Come mostrato in (Figura 4.16 C), già dopo 6h di trattamento si otteneva un aumento delle cellule positive alla colorazione con Annessina/PI.

Figura 4.16. L’NVP-BEZ235 induce citotossicità ed apoptosi in cellule di LAL-T. A: saggio MTT su linee

cellulari trattate NVP-BEZ235 per 24 h. I risultati sono espressi come media di tre esperimenti indipendenti ± Deviazione Standard (SD). L’asterisco indica una differenza statisticamente significativa (p<0.005) rispetto alle cellule non trattate. B: confronto dell’effetto dell’ NVP-BEZ235 e del PI-103 in linee cellulari di LAL-T. tramite saggi MTT. C: colorazione conAnnessina V FITC/PI: le cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti di NVP-BEZ235 per 6 h. D: analisi del ciclo cellulare tramite colorazione con PI di linfociti T CD4+, isolati dal sangue periferico di donatori sani e stimolati con fitoemoagglutinina e interleuchina 2.

L’analisi del ciclo cellulare ha mostrato inoltre come il trattamento con concentrazioni crescenti di NVP-BEZ235 causasse un forte accumulo di cellule in fase G0/G1, già dopo 16 h ore di trattamento, sia in cellule Molt-4, sia in cellule CEM-R, accompagnato da una defosforilazione della proteina del Retinoblastoma (pRB, Figura 4.17). Le cellule Jurkat, invece, erano caratterizzate da una maggiore presenza di cellule in subG1, e non mostravano una defosforilazione significativa

Risultati

51

della pRB. (Figura 4.17). Linfociti T CD4+_{, isolati dal sangue periferico di donatori sani e stimolati}

con fitoemoagglutinina e interleuchina 2 si sono dimostrati molto meno sensibili all’NVP-BEZ235 a concentrazioni pari a 500 nM (Figura 4.16 D). Infatti, l’analisi del ciclo cellulare tramite citofluorimetria a flusso non ha mostrato un significativo accumulo di cellule in fase G0/G1 o un aumento dell’apoptosi. Nel loro complesso questi risultati indicano come l’NVP-BEZ235 riduca considerevolmente la proliferazione delle linee cellulari di LAL-T analizzate e questo effetto è dovuto sia all’arresto del ciclo cellulare che all’apoptosi. Inoltre, il farmaco potrebbe avere un utilizzo terapeutico favorevole in quanto non influenza la proliferazione dei linfociti T CD4+ _normali.

Figura 4.17. L’NVP-BEZ235 induce accumulo di cellule in fase G0/G1 del ciclo cellulare accompagnato dalla defosforilazione della proteina pRb. A: analisi in western blot della fosforilazione

della proteina Rb in Jurkat, Molt-4 e CEM-R. in seguito a trattamento con NVP-BEZ235 (200 nM). B: analisi del ciclo cellulare tramite colorazione con PI in Jurkat, Molt-4 e CEM-R trattate con NVP-BEZ235 per 16 h.

4.3.2. L’NVP-BEZ235 induce attivazione delle caspasi

Una caratteristica tipica delle cellule apoptotiche è l’attivazione di una famiglia di proteasi definite caspasi, responsabili per la maggior parte dei cambiamenti biochimici e morfologici che caratterizzano l’apoptosi. Analisi condotte in western blotting su estratti proteici di CEM-R, Molt-4, Jurkat ed RPMI 84-02, trattate con NVP-BEZ235, hanno documentato il clivaggio delle procaspasi 8, 9 e 3, già dopo 3 h di trattamento (Figura 4.18)

Figura 4.18. Il trattamento con NVP-BEZ235 induce attivazione dell’apoptosi attraverso il clivaggio della caspasi-8 della caspasi-9 e della caspasi-3. Analisi in western blot di cellule Molt-4, RPMI-8402,

Risultati

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4.3.3. Effetto dell’ NVP-BEZ235 sui componenti critici dell’asse di sopravvivenza di PI3K/Akt/mTOR nelle cellule di LAL-T

Analisi in western blot mostravano una diminuzione concentrazione-dipendente della fosforilazione di AKT (Ser473) in risposta al trattamento con NVP-BEZ235 per 24 h (Figura 4.19). Inoltre il farmaco era in grado di indurre una defosforilazione anche sui bersagli a valle di mTOR (p70S6K, 4E-BP1, and S6RP).

Figura 4.19. L’ NVP-BEZ235 modula l’asse di sopravvivenza di PI3K/Akt/mTOR nelle linee cellulari di LAL-T. Analisi in western blot di cellule trattate con NVP-BEZ235 per 24 h.

4.3.4. L’NVP-BEZ235 sinergizza con agenti chemioterapici tradizionali utilizzati per il trattamento delle LAL-T e diminuisce la resistenza alla Vincristina in cellule Jurkat

Le linee cellulari Molt-4, Jurkat ed RPMI-8402 sono state incubate in presenza di Vincristina (VCR), Ciclofosfamide (Cyclo), ARA-C e NVP-BEZ235 singolarmente o in combinazione, in rapporto costante. Il trattamento combinato è risultato essere fortemente citotossico, come dimostrato dal saggio di proliferazione cellulare MTT a 24 h (Figura 4.20 A). Il valore di combination index (CI) per ogni punto è stato calcolato con il software per l’analisi della dose effettiva CalcuSyn. I valori di CI indicano l’esistenza di un forte sinergismo tra l’NVP-BEZ ed i vari agenti chemioterapici, in particolare con l’ARA-C (CI<0.3).

La combinazione dell’NVP-BEZ235 con la Vincristina riduceva inoltre la resistenza alla Vincristina, indotta in cellule Jurkat dalla co-coltura con cellule stromali MS-5, che sono state utilizzare al fine di mimare le interazione fra cellule leucemiche ed il microambiente midollare [Konopleva et al., 2002]. L’anticorpo contro il CD45 è stato utilizzato per escludere dall’analisi le cellule stromali e le analisi sono state effettuate tramite colorazione con Annessina V-FITC per determinare l’effetto del doppio trattamento (Figura 4.20 B).

Figura 4.20. La combinazione di NVP-BEZ235 con vari agenti chemioterapici (Vincristina, Ciclofosfamide, ARA-C) è sinergica in cellule MOLT-4, JURKAT ed RPMI-8402 e riduce la resistenza alla Vincristina indotta dalla co-coltura con cellule stromali. A: saggio MTT in presenza di NVP-BEZ235

(nM),Vincristina (VCR, nM), Ciclofosfamide (Cyclo, nM) e ARA-C (nM) somministrati singolarmente, o in combinazione in rapporto costante. Sono mostrati i valori di combination index (CI) ottenuti tramite il software di analisi per gli effetti combinati Calcusyn. B: colorazione con Annessina V-FITC e CD45-PE di cellule Jurkat trattate con NVP-BEZ235 e VCR somministrate singolarmente oppure in combinazione, in presenza/assenza di cellule stromali MS-5.

Risultati

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4.3.5. Effetto dell’NVP-BEZ235 su blasti di pazienti pediatrici affetti da LAL-T con attivazione costitutiva dell’asse di PI3K/AKT/mTOR

L’NVP-BEZ235 è risultato citotossico su blasti provenienti da pazienti pediatrici con LAL-T, che mostravano fosforilazione costitutiva di 4E-BP1 e S6RP e bassa/assente espressione di PTEN, sui quali è stata analizzata l’attività metabolica tramite saggi MTT. I risultati hanno mostrato come il farmaco, in seguito a 96h di trattamento, abbia indotto citotossicità ( IC50<25 nM) nei pazienti

analizzati. In Figura 4.21 A sono mostrati tre pazienti rappresentativi. Analisi citofluorimetriche ed in western blot mostrano come il trattamento con NVP-BEZ235 (200 nM, 48 h) abbia indotto una defosforilazione sia di 4E-BP1, sia della proteina S6RP, mentre il trattamento con Rapamicina (100 nM, 48h) è stato in grado di indurre una diminuzione solo di p-S6RP (Figura 4.21).

Figura 4.21. L’NVP-BEZ235 induce citotossicità in blasti leucemici provenienti da pazienti pediatrici affetti da LAL-T, con fosforilazione costitutiva di 4E-BP1 e S6RP e bassa/assente espressione di PTEN A: saggio MTT su blasti trattati con NVP-BEZ235 a concentrazioni crescenti per 96 h. I risultati sono la

media di 2 esperimenti indipendenti ± SD. Tre pazienti rappresentativi sono mostrati. B: analisi citofluorimetrica di campioni di LAL-T per i livelli di fosforilazione di Thr 37/46 p-4E-BP1 e Ser 235/236 p- S6RP in seguito a trattamento con NVP-BEZ235 (200 nM) o Rapamicina (100 nM) per 48 h. Tre pazienti rappresentativi sono mostrati. C: analisi citofluorimetrica di tre campioni rappresentativi di LAL-T per l’espressione di PTEN D: analisi in western blot di due campioni di LAL-T trattati con Rapamicina (100 nM) o NVP-BEZ235 (200 nM) per 48 h.

Risultati

57

4.3.6. L’NVP-BEZ235 agisce sulle cellule della side population (SP) di cellule di LAL-T

L’NVP-BEZ235 infine è stato efficace anche nel colpire la SP, identificata con Hoechst 33342 e marcatura con ABCG2. Nelle AML e in vari tipi di tumori solidi, le cellule della SP sono fortemente arricchite in cellule staminali leucemiche ed inoltre sono contraddistinte da un’elevata espressione del trasportatore di membrana ABCG2 ( BCRP, Breast Cancer Resistance Protein) [Bleau et al., 2009; Ho et al., 2007; Shukla et al., 2008; Wulf et al., 2001]. Le cellule sono state marcate con il colorante vitale Hoechst 33342, in grado di legarsi al DNA e renderle così fluorescenti (Figura 4.22, 4.23). L’Hoechst è una bis-benzimide molto lipofilica e quindi in grado di attraversare la membrana cellulare intatta. In seguito al suo legame al DNA, esso emette sia nel blu a 424/44 nm, sia nel rosso a 622/30 nm, una volta eccitato dalle radiazioni ultraviolette (UV 350 nm), ma questo non avviene nelle cellule con caratteristiche di staminalità, che iperesprimono vari trasportatori di membrana che pompano all’esterno il colorante.

Il saggio prevede che un’aliquota della popolazione cellulare che contiene le presunte cellule staminali venga preincubata con fumitremorgina c, farmaco in grado di bloccare in maniera selettiva la pompa ABCG2 che esclude l’Hoechst. Perciò, confrontando la distribuzione nei canali di emissione dell’Hoechst delle cellule trattate rispetto a quelle non trattate con la fumitremorgina c, è possibile identificare la regione delle cellule che costituiscono la SP. I blasti di LAL-T sono stati marcati inoltre con un anticorpo contro ABCG2 coniugato con ficoeritrina (PE). Il trattamento con NVP-BEZ235 e con Rapamicina è stato in grado di indurre la scomparsa o una forte riduzione della SP, sia in linee cellulari come Molt-4, CEM-S e BE-13, sia in blasti di pazienti pediatrici affetti da LAL-T (Figura 4.23).

Figura 4.22. L’NVP-BEZ235 riduce la Side Population (SP) in linee cellulari di LAL-T. Le cellule Molt-4,

CEM-S e BE-13 sono state trattate con Rapamicina (100 nM) o NVP-BEZ235 (200 nM) per 24 h e in seguito colorate con Hoechst 33342 (5 μg/mL) e analizzati tramite i citofluorimetria a flusso.

Risultati

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Figura 4.23. L’NVP-BEZ235 riduce la Side Population (SP) in blasti di pazienti pediatrici di LAL-T. Le

cellule sono state trattate con Rapamicina (100 nM) o NVP-BEZ235 e in seguito colorate con Hoechst 33342 (5 μg/mL) in presenza/assenza di Fumitremorgina C ed è stata effettuata una doppia marcatura con un anticorpo monoclonale contro ABCG2 coniugato con PE.

Discussione

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Data l’importanza dell’asse di sopravvivenza di PI3K/AKT/mTOR in numerose neoplasie, è di grande importanza studiare nuove strategie terapeutiche per modulare negativamente questa attivazione, ponendosi come obiettivo l’arresto della crescita cellulare, l’apoptosi e il miglioramento delle condizioni cliniche del paziente. Anche il modello cellulare utilizzato in queste ricerche (linee cellulari di LAL-T e linfoblasti di pazienti pediatrici affetti da LAL-T) mostrava un’attivazione costitutiva dell’asse di segnalazione della PI3K/AKT/mTOR.

Un esiguo numero di farmaci inibitori dell’asse di PI3K/AKT/mTOR sono a tutt’oggi in via di sviluppo, quindi è importante focalizzarsi sullo sviluppo di ulteriori strategie terapeutiche.

Il razionale della terapia mirata potrebbe essere fondamentalmente quello di testare questi composti in un ampio numero di tumori per identificare in quali forme neoplasiche possano essere efficaci ed inoltre di usare i dati preclinici più interessanti al fine di elaborare trials clinici specifici per il fenotipo dei singoli pazienti.

Le nuove strategie terapeutiche prevedono l’utilizzo di inibitori mirati verso molecole target dell’asse, i quali possono avere come bersaglio un unico target (singoli inibitori specifici) o una doppia inibizione (doppi inibitori specifici) in modo da rendere più robusto l’arresto della crescita cellulare e superare il problema della farmacoresistenza. La limitata efficienza dei singoli inibitori può essere inoltre causata dall’instaurarsi di mutazioni che determinano la resistenza a quel particolare inibitore.

Ad esempio la singola inibizione di mTORC1, tramite il suo inibitore specifico, la Rapamicina, ma non di mTORC2, determina una attivazione del segnale dell’asse attraverso un meccanismo di feedback e ciò spiega ad esempio la limitata efficacia della Rapamicina in tumori epiteliali.

E’ importante anche valutare il confronto tra le nuove molecole studiate e i più tradizionali chemioterapici (come ad esempio Viincristina, ARA-C) nel trattamento farmacologico delle LAL-T, per evidenziare eventuali sinergismi che hanno una maggiore efficacia dei singoli trattamenti.

5.1.

Inibizione AKT-specifica con Perifosina

La Perifosina è un nuovo farmaco sintetico appartenente alla classe delle alchilfosfocoline, una nuova classe di agenti antitumorali. La Perifosina è un analogo dei fosfolipidi di membrana che presenta un residuo ciclico alifatico alchilico legato al gruppo fosfato. Gli alchilfosfolipidi hanno tre effetti principali che possono spiegare la loro citotossicità. Sono infatti in grado di interferire con il turnover e la sintesi dei fosfolipidi di membrana, con i meccanismi di trasduzione del segnale e sono in grado di bloccare la sopravvivenza delle cellule tumorali attraverso la modulazione di vie di segnalazione come PI3K/Akt and ERK 1/2. Essi inoltre inducono segnali di stress e apoptosi attraverso l’attivazione delle caspasi[Van Ummersen et al., 2004; Vink et al., 2007].

La Perifosina, già in fase di sperimentazione in trials clinici di fase I/II in tumori solidi, non ha causato tossicità a livello ematologico e ciò è in accordo con recenti risultati ottenuti in questo

laboratorio, in cui il farmaco non ha indotto tossicità in cellule emopoietiche CD34+ provenienti da donatori sani [Papa et al., 2008]. In modelli murini in vivo di MM, la Perifosina ha indotto invece iperplasia mieloide.

In questo studio è stato testato l’effetto della Perifosina nel diminuire la sopravvivenza di cellule PTEN-negative di LAL-T, CEM, compreso un subclone che overesprime la P-gp (CEM-R).

La Perifosina è stata efficace nell’indurre citotossicità, in maniera concentrazione-dipendente, in cellule CEM-S e CEM-R. Gli IC50 ottenuti per le CEM-S erano inferiori a quelli delle CEM-R

(rispettivamente 6.8 μM e 19.3 μM), e ciò potrebbe rispecchiare la maggiore espressione della forma fosforilata sullla Ser473 di AKT nelle CEM-R rispetto alle CEM-S.

La diminuzione della sopravvivenza era dovuta ad un aumento dell’apoptosi, come indicato dalle analisi effettuate tramite colorazione con Annessina V-FITC/PI; inoltre l’analisi in western blotting ha documentato il clivaggio delle caspasi 9, 8 e 3. L’attivazione della caspasi 3 è risultata anche nel clivaggio dei suoi substrati PARP e Bid. Una doppia marcatura in immunocitochimica, nella quale è stato marcato il citocromo C ed il complesso V, localizzato a livello mitocondriale, ha confermato come la Perifosina abbia indotto in cellule CEM-R l’attivazione del pathway intrinseco mitocondriale. Questi dati mostrano quindi che la Perifosina ha attivato sia il pathway apoptotico estrinseco che quello intrinseco.

Nelle cellule CEM-R si osservava inoltre una defosforilazione di AKT sia sulla Ser473, che sulla Thr308. La Perifosina non induceva invece una’attivazione di ERK1/2, come è stato osservato in altri modelli cellulari.

Recenti studi ottenuti su cellule di MM, hanno mostrato che l’apoptosi indotta dalla Perifosina dipende dal reclutamento del recettore Fas/CD95, della proteina FADD e della procaspasi 8 nei lipid rafts, portando alla formazione del complesso DISC. I nostri risultati hanno suggerito che l’integrità dei lipid rafts sia molto importante per indurre apoptosi attraverso l’utilizzo di Perifosina. In cellule di MM, la citotossicità mediata dalla Perifosina non dipendeva da FasL, mentre nelle cellule CEM-R, l’effetto proapoptotico del farmaco era almeno in parte dovuto a FasL. Infatti l’utilizzo di un anticorpo monoclonale contro Fas causava una diminuzione dell’apoptosi indotta dalla Perifosina.

I risultati ottenuti hanno messo in evidenza come anche JNK sia un altro mediatore importante nel processo apoptotico mediato dalla Perifosina nelle cellule CEM-R. Il trattamento con Perifosina infatti, ha indotto un aumento della fosforilazione di JNK. Quando le cellule venivano preincubate con un inibitore di JNK (SP600125) e poi trattate per 6 h con Perifosina, si riscontrava una marcata diminuzione dell’apoptosi nelle cellule analizzate. I dati mostrati quindi sono risultati in accordo con quelli di Hideshima [Hideshima et al., 2006], che ha dimostrato il ruolo fondamentale dell’attivazione di JNK nell’indurre apoptosi in cellule di MM trattate con Perifosina.

Discussione

62

E’ stato inoltre dimostrato come la Perifosina sia stata in grado di ridurre l’espressione dell’mRNA e l’espressione proteica della P-gp; al contrario, il trattamento con l’inibitore di JNK SP600125, o il silenziamento genico di JNK contrastava la modulazione negativa della trascrizione di MDR-1. Nonostante la quantità di mRNA fosse calata dopo 6 h di trattamento con Perifosina, l’espressione proteica cominciava a diminuire in seguito a 16 h di trattamento e fortemente ridotta dopo 24 h. Questo potrebbe dipendere soprattutto dal fatto che l’emivita della P-gp è circa di 15-18 h, come riportato in alcune linee cellulari tumorali, che esprimono MDR1 [Argiris et al., 2006; Miao and Ding, 2003; Zhou et al., 2006].

I nostri risultati sono in accordo con altri studi che mettono in evidenza come nelle linee di tumori solidi e nelle cellule di eritroleucemia K562, la diminuzione dell’espressione dell’mRNA della P-gp necessiti dell’attività catalitica di JNK e come ciò sia mediato dal fattore di trascrizione c-jun.

La Perifosina determina una fosforilazione di c-Jun sulla Ser63 e l’attivazione dell’attività trascrizionale di AP1, che può essere contrastata da un inibitore selettivo di JNK. A tutt’oggi come avvenga la regolazione trascrizionale del gene di MDR1 non è ancora del tutto chiarito. E’ stato riportato che il promotore del gene contenga un sito di legame negativo per il fattore che attiva la trascrizione AP1. Tuttavia è anche risaputo che in molte linee cellulari tumorali resistenti ai farmaci, l’aumento dell’espressione della P-gp è dovuto ad un aumento dei livelli di mRNA. Oltre ad AP1, altri fattori di trascrizione sono coinvolti nella regolazione della trascrizione genica di MDR1, come HSF1 e MEF1. Anche la proteina p53 sembra essere coinvolta sia positivamente che negativamente nella regolazione della trascrizione di MDR1.

E’ noto che la P-gp sia presente a livello dei lipid rafs, anche se presenta una maggiore attività quando è localizzata al di fuori dei lipid rafts. Siccome la Perifosina si accumula nei lipid rafts,