Polimorfisimi dell’Acetilcolinesterasi 69

Analisi biochimiche dell’AChE da organi elettrici dei pesci e da altri tessuti hanno permesso la caratterizzazione di diverse forme molecolari dell’enzima. I polimorfismi dell’AChE derivano principalmente dallo splicing alternativo a livello genico sull’estremità 3’ del trascritto, il quale, genera diverse varianti di AChE che differiscono nelle loro modificazioni post-traslazionali e nelle proprietà di oligomerizzazione (Massoulié et al 2008). Nei mammiferi infatti l’AChE è codificata da un singolo gene, il quale sembra possedere molti siti di inizio trascrizione, con pattern alternativi di splicing subito prima dell’esone di codifica; ciò permette una scelta alternativa del sito accettore di splicing nella regione 3’ del trascritto (Li et al 1993; Atanasova et al 1999). Questo genera proteine che hanno lo stesso dominio catalitico di circa 500 aminoacidi, ma differiscono per un piccolo peptide con meno di 50 residui, denominato peptide C-terminale. In dipendenza della diversa scelta del sito accettore di splicing, seguente l’esone costitutivo che codifica la parte C-terminale del comune dominio catalitico, una parte più o meno estesa di pre-mRNA può essere rimossa per posizionare diverse sequenze che determinano peptidi C-terminali diversi (Massolulié et al 2008). Normalmente questi processi danno luogo a tre forme di trascritti: nell’AChE di mammifero, l’assenza di splicing nella regione 3’ genera il trascritto R (“readthrough” trancscript), il primo sito accettore genera il trascritto H (“hydrophobic” transcript), e il sito accettore posizionato a valle genera il trascritto T (“tailed” transcript) (Li et al 1991).

Figura 4.5 Rappresentazione schematica del gene dell’AChE e relativi trascritti classificati per tipo di

splicing.

Il trascritto R è stato caratterizzato in Torpedo californica e nei mammiferi. Questo trascritto si genera per mancanza di splicing nella regione 3’ del gene e di solito è presente solo in piccole quantità; esiste in linee cellulari trasformate ed in tessuti embrionali, aumenta in condizioni di avvelenamento da inibitori dell’AChE o in seguito a stress acuti in topi e stress termici in cellule in coltura (Massoulie et al 2005). Comunque la presenza

Sistemi Biologici di Studio

di questa forma in vivo è molto bassa, meno del 2% dell’AChE totale attiva nel cervello, perciò si presume che il contributo alla regolazione colinergica attraverso l’idrolisi dell’ACh nel sistema nervoso sia molto scarso (Perrier et al 2005).

Il trascritto H codifica per l’AChEH, una forma molecolare che esiste negli insetti, nei nematodi, negli anfibi protocordati e in alcuni vertebrati come in Torpedo e nei mammiferi. Il trascritto H esprime un peptide C-terminale chiamato h (―hydrophobic‖) caratterizzato dalla presenza di una regione per l’introduzione di glicofosfatidilinositolo (GPI-addition), attraverso il quale una forma dimerica dell’enzima si ancora alla membrana. In Torpedo queste forme molecolari ancorate attraverso GPI esistono nel cervello e negli organi elettrici, mentre nei mammiferi sono espresse principalmente sulla superficie degli eritrociti. Questo enzima legato alla membrana sembra avere molti ruoli soprattutto nella regolazione della permeabilità di membrana (Massoulié et al 2005). Inoltre, in accordo con alcuni studiosi la presenza di questa forma sulla superficie degli eritrociti, gioca un ruolo fondamentale nell’idrolisi di qualsiasi molecola di Ach che diffonde all’interno del flusso sanguigno (Silver, 1974).

Il trascritto T (―tailed‖) è presente in tutti i vertebrati, e al contrario di H ed R sembra relazionato sia a vertebrati che invertebrati. L’AChET viene espressa in seguito allo splicing alternativo del gene codificante che da luogo alla formazione di un peptide t C- terminale di circa 41 residui aminoacidici, che permette alle subunità di AChE di formare omo-oligomeri, principalmente dimeri e tetrameri, associati alle membrane per mezzo di proteine di ancoraggio. Sono state caratterizzate due tipi di proteine di ancoraggio: il collagene ColQ (Krejci et al 1991 e 1997) e la proteina di transmembrana PRiMA (Perrier et al 2002). Nel primo caso, i tetrameri di AChE si congiungono ai filamenti di collagene ColQ, generando una forma molecolare ancorata alle membrane attraverso una coda di collagene (collagen-tailed forms). Nel secondo caso, i tetrameri si congiungono al PRiMA (Proline Rich Membrane Anchor), una proteina di transmembrana ricca in proline per mezzo della quale l’AChE si ancora alla membrana. L’associazione tra le subunità catalitiche del’AChE e le proteine di ancoraggio ColQ e PRiMA prevede l’interazione tra il C-terminale e il PRAD (proline-rich attachment domain), ossia un dominio di ancoraggio ricco di proline, localizzato nelle regioni N-terminali delle proteine di ancoraggio (Bon et al 1997). Nelle forme legate alle code di collagene le cisteine di due t peptidi formano legami disolfuro con due cisteine localizzate vicino all’elemento ricco in proline del ColQ. Nelle forme associate al PRiMA, quattro cisteine poste sulle estremità maggiori del suo elemento ricco in proline, potrebbero legarsi a tutti e quattro i t peptidi,

Sistemi Biologici di Studio

sebbene è comunque riportato che il PRiMA è legato a solo due subunità dell’AChET nei complessi eteromerici isolati nel cervello (Massoulié et al 2005). Nei mammiferi la variante ancorata mediante la coda di collagene ColQ gioca un ruolo fondamentale a livello della giunzione neuromuscolare (Feng et al 1999), viceversa quella ancorata mediante PRiMA sembra essere la specie più presente a livello celebrale (Perrier et al 2003).

Figura 4.6 Rappresentazione schematica delle principali forme molecolari di AchE derivanti da splicing

alternativo.

Tuttavia, come è stato riportato da Schweitzer, si ritiene che molecole di acetilcolinesterasi possano trovarsi anche segregate all’interno di compartimenti citoplasmatici come vescicole secretorie. La disponibilità dell’inibitore dell’AChE impermeabile alle membrane, fosfolina, ha permesso di effettuare dei test critici per validare questa possibilità (Inestrosa et al. 1981). Infatti, in seguito al trattamento di cellule intatte con una soluzione 1 μM di fosfolina, è stato mostrato che nè i livelli basali, nè il rilascio stimolato di AChE veniva ridotto, a dimostrazione del fatto che l’AChE era associata a compartimenti che la proteggevano dalla fosfolina; questi compartimenti presumibilmente corrispondevano a vescicole secretorie localizzate nel citoplasma cellulare (Schweitzer, 1993).

Sistemi Biologici di Studio