catalizzatore per la formazione dell‟intermedio metallaciclobutanico. Comunque, l‟uso di un gruppo protettore per l‟azoto amminico è necessario, non solo per un eventuale utilizzo degli amminoacidi modificati in sintesi peptidica, ma anche perchè il gruppo amminico libero, capace di complessare il Ru, non è compatibile con il catalizzatore 66. Al contrario non occorre proteggere il gruppo carbossilico che è compatibile con la reazione di CM catalizzata da 66.
Analogamente all‟allilossazolidinone 71, anche 70 può essere considerato come un‟olefina del terzo tipo secondo la classificazione di Grubbs e coll.67 Infatti l‟ingombro sterico esercitato
dall‟anello pirrolidinico-2-sostituito legato al C allilico dovrebbe favorire il processo di eterodimerizzazione rispetto a quello di omodimerizzazione. Anche in questo caso, la nostra ipotesi è stata confermata dall‟assenza del prodotto di omodimerizzazione nella miscela di reazione di CM di 70 con vari alcheni lineari.
Sfruttando il riscaldamento tramite irraggiamento con MW (T= 80 ºC, 20 min, 150 Watt, metodo instant cooling) la N-Boc-allilprolina 70 è stata fatta reagire con l‟1-eptene (85) in presenza del catalizzatore di Grubbs 66 in CH2Cl2. In queste condizioni (2 eq. eptene 85 e 5% cat. di Grubbs
66), è stato ottenuto il composto 90 con una resa del 72%. Da notare come, in condizioni
analoghe, la reazione condotta sui due derivati 70 e 71 con 1-eptene (85) avvenga con rese paragonabili (72% e 75% rispettivamente).
Anche in questo caso abbiamo potuto osservare come un aumento degli equivalenti dell‟olefina a catena lunga porti ad un notevole incremento della resa, infatti, con 7 equivalenti di 1-eptene (85), la resa del prodotto di cross-metatesi è stata del 92%. (Tab. 2, reazione d).
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Con l‟1-dodecene (87), mantenendo le stesse condizioni sperimentali utilizzate nel caso precedente, la reazione di CM ha portato alla formazione del composto 91 con una resa del 86%. Data l‟alta reattività delle olefine terminali verso le reazioni di CM si osserva come un allungamento della catena non porta a sostanziali variazioni sulla selettività del processo. (Tab. 2, reazione e).
L‟N-Boc-allilprolina 70 è stata poi fatta reagire con il metilestere dell‟acido 1-undecenoico (76). Il composto 92 è stato ottenuto nelle condizioni usuali con una resa del 63% (Tab. 2, reazione f). In questo caso non è stata riscontrata diastereoselettività. L‟introduzione del gruppo estereo terminale, come precedentemente osservato per la prolina 71, sembra sfavorire in termini di resa la reazione di CM. Questo trend viene confermato anche dalla reazione con l‟undecenolo 77 in cui la resa del prodotto 93 risulta abbassata al 40%. (Tab. 2, reazione g) ed una precedente protezione della funzione alcolica come sililetere 78 non ha portato miglioramenti della resa del prodotto di CM (Tab. 2, reazione l).
Numerosi studi di CM, tra cui quelli effettuati da Cossy e colleghi mostrano come il gruppo ossidrilico libero sia compatibile con questo metodo sintetico.86 È plausibile pensare, quindi, che
la resa della reazione possa essere ottimizzata, ad esempio, incrementando i tempi di reazione o cambiando solvente. Un modesto aumento della resa (da 40 a 56%), infatti, è stato osservato effettuando la reazione in THF e con l‟impiego di una quantità doppia di catalizzatore 66 (Tab. 2, reazione h).
Infine, la reazione di CM è stata utilizzata per legare allo scaffold prolinico una catena più complessa, funzionalizzata in posizione terminale con la 2,3,4,6-tetra-O-acetil--D-
glucopiranosilammina 84.
Al derivato prolinico 70 sciolto in CH2Cl2, sono stati aggiunti 2.0 equivalenti dell‟olefina 84 e 10
mol% di catalizzatore di Grubbs 66. La miscela di reazione è stata scaldata a 80 ºC tramite irraggiamento con MW per 20 minuti e controllata via TLC. A differenza dei casi precedenti, dopo 20 min la reazione non era completa per cui la miscela di reazione è stata nuovamente irraggiata nelle stesse condizioni. Il prodotto 94 è stato quindi ottenuto, dopo purificazione su colonna cromatografica, con una resa del 29%.
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Quindi, nonostante l‟uso di una quantità maggiore di catalizzatore 66 e del tempo di reazione più lungo è stato osservato un ulteriore abbassamento della resa che sembra legato all‟aumento nella complessità dell‟olefina. Questo dato può essere spiegato considerando un‟interferenza dei gruppi funzionali in posizione terminale dell‟alchene di tipo I nella formazione dell‟eterodimero. Per esempio, si può supporre che queste olefine in un solvente poco polare come il CH2Cl2, formino
degli aggregati tramite interazioni secondarie, come il legame a idrogeno, favorendo reazioni collaterali come l‟omodimerizzazione rispetto all‟eterodimerizzazione e sfavorendo reazioni di CM secondarie con l‟alchene di tipo III. In questo caso abbiamo ritenuto utile giocare sull‟effetto solvente e sulla diluzione per cercare di ottenere rese migliori. Come nel caso in cui il partner dell‟N-Boc-allilprolina 70 per la CM era l‟olefina 77, l‟impiego del THF come solvente unito ad una maggiore quantità del catalizzatore 66 ha permesso di ottenere il prodotto desiderato 94 con una resa del 48% (Tab. 2, reazione h) notevolemente più alta di quella ottenuta in CH2Cl2 (29%).
E‟ noto in letteratura che un acido di Lewis come il Ti(OiPr)4 può essere usato per incrementare
le rese del prodotto di metatesi quando sui reagenti sono presenti basi di Lewis.87, 88
Con l‟introduzione di un acido di Lewis come il Ti(OiPr)4 96 (20 mol%) come co-catalizzatore
insieme a 66 (5 mol%) si migliora l‟attività catalitica del processo e le rese sono risultate leggermente più alte (Schema 25).89 Si osserva come in presenza della funzione alcolica sull‟
olefina lineare è meglio utilizzare l‟acido di Lewis che ricorrere ad una protezione della funzione ossidrilica.
87 Fürstner, A.; Langemann, K. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 9130.
88 Per recenti esempi sull‟uso del Ti(Oi-Pr)4 in CM, vedi: C.-W. Chang, Y.-N. Chen, A. K. Adak, K.-H. Lin, D.-L. M.
Tzou, C.-C. Lin, Tetrahedron 2007, 63, 4310.
89 Per CM su acidi carbossilici insaturi in presenza di Ti(Oi-Pr)4, vedi: Bai, C.–X.; Lu, X.–B.; He, R.; Zhang, W. Z.;
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Schema 25: CM tra 70 ed olefine 76, 77, 85 (2 equiv.) in presenza del catalizzatore di Grubbs 66
(5 mol%) e Ti(OiPr)4 96 (20 mol %). Tra parentesi le rese nelle stesse condizioni, ma in assenza di
Ti(OiPr)4 96.
Oltre ai problemi nella stereochimica del doppio legame formato in seguito a reazioni di CM sull‟allilossazolidinone 71, per le reazioni sulla prolina 70, nascono problemi di assegnazione dovuti alla formazione di due conformeri del gruppo Boc. L‟analisi degli spettri 1H-NMR delle
proline α-alchilate 90-95 in CDCl3 mostra la presenza di una miscela di due conformeri apparentemente a sola configurazione E (Jtrans= 15 Hz), mentre non è stata osservata la presenza
dell‟isomero Z nel grezzo di reazione.
Le proline α-sostituite 90-95, a differenza dei corrispondenti derivati ossazolidinonici 86, 88 e 89, possono essere facilmente idrogenate a pressione atmosferica in presenza di una quantità catalitica di Pd(OH)2/C in metanolo. Le reazioni hanno portato alla formazione dei
corrispondenti prodotti a catena satura 97-102 con buone rese (76-86%) (Schema 26), anch‟essi ottenuti come miscela di due conformeri.
Schema 26: Idrogenazione degli alcheni 90-95
Gli amminoacidi così ottenuti risultano opportunamente protetti per poter essere direttamente utilizzati nella sintesi di lipopeptidi.19
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La prolina glucosilconiugata 102 fornisce un nuovo interessante esempio di amminoacido glicosilato. Tali molecole sono oggetto di intensi sforzi da un punto di vista sintetico per una loro potenziale applicazione come tools biologici in glicopeptidomimetica.90
Le catene funzionalizzate con gruppi carbossilici o idrossilici nelle proline 99-102 potrebbero servire per legare l‟amminoacido ad altre funzioni, per favorire le interazioni con recettori, o per fissarli su fase solida. Sviluppi in sintesi peptidica verso tali direzioni saranno oggetto di ulteriori studi nel nostro gruppo di ricerca.
Studi preliminari per verificare la possibilità di inserimento delle lipoproline 97-102, opportunamente modificate, al posto di residui prolinici o analoghi di piccoli peptidi biologicamente attivi, hanno mostrato come sia possibile effettuare il coupling sulla funzione acida di tali amminoacidi.
Il dipeptide 104 ottenuto per accoppiamento tra l‟amminoacido 97 ed il cloridrato della glicina metilestere 103 in ambiente anidro utilizzando PyBroP come attivante, è stato ottenuto con una buona resa (72%, Schema 27). Il trattamento di tale dipeptide 104 con TFA in CH2Cl2 ha portato alla deprotezione della funzione amminica terminale con rese quantitative. Purtroppo non è stato possibile per ora effettuare coupling sulla funzione amminica terminale di 105 con quella acida della Boc-L-fenilalanina 106 (Schema 28), probabilmente a causa del notevole ingombro sterico creato
dalle due catene in
Schema 27: Sintesi del dipeptide Pro-Gly 104
90 Per alcune recenti reviews su glicoproteine e amminoacidi glicosilati, vedi: (a) Risseeuw, M. D. P.; Overhand, M.;
Fleet, G. W. J.; Simone, M. I. Tetrahedron: Asymmetry 2007, 2001. (b) Groothuys, S.; Kuijpers, B. H. M.; Quaedflieg, P. J. L. M.; Roelen, H. C. P. F.; Wiertz, R. W.; Blaauw, R. H.; Van Delft, F. L.; Rutjes, F. P. J. T. Synthesis 2006, 3146. (c) Dondoni, A.; Marra, A. Chem. Rev. 2000, 100, 4395.
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Schema 28: Sintesi del tripeptide Phe-Pro-Gly.
I risultati dello studio di CM sulle proline α-sostituite 58 sono stati oggetto di una pubblicazione sulla rivista European Journal of Organic Chemistry.91
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4
4..5 5
CCONONCCLLUUSSIOIONNII::
L‟obiettivo di questo lavoro era quello di ottenere una libreria di proline α-sostituite con catene lipofile da utilizzare nella sintesi di peptidomimetici con lo scopo di modificare la struttura secondaria (attraverso l‟induzione di β-turn) e variare le proprietà biologiche (ad esempio la capacità di attraversare la membrana cellulare) dei peptidi di riferimento.
La metodologia sfruttata per ottenere tali lipoproline è stata la cross-metatesi (CM) tra allilproline 70 e 71 enantiomericamente pure e olefine di varia lunghezza e diversamente funzionalizzate.
E‟ stato condotto con successo uno studio metodologico delle condizioni di tali reazioni di CM per ottimizzare le rese dei prodotti e per cercare di individuare la stereochimica del doppio legame formatosi.
Sono stati confrontati due processi sintetici alternativi che utilizzano la reazione di CM a livelli diversi della sintesi ed è stato provato che è più efficiente la strategia che prevede la CM sull‟intermedio più „avanzato‟ 70.
Tentativi preliminari di coupling con amminoacidi condotti su un derivato prolinico hanno mostrato come questo possa essere realizzato con buone rese sulla funzione acida, mentre, per il notevole ingombro sterico, non ha avuto successo sulla funzione amminica.
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4
4.6.6
PPAARRTETE SSPPERERIMIMENENTATALLEE
I reagenti utilizzati di cui non è riportata la sintesi sono commercialmente disponibili (Aldrich, Fluka) e, se non specificato, sono stati impiegati senza ulteriore purificazione. Le reazioni condotte per irraggiamento di microonde sono state eseguite con un apparecchio Cem Discover. Gli spettri IR sono stati registrati con uno spettrometro Perkin Elmer 881.Gli spettri NMR sono stati registrati con strumenti Varian Gemini 200 MHz o con 400 MHz Mercury400; i valori di chemical shift sono riportati in ppm e sono relativi al segnale del TMS ( = 0.00 ppm). Il solvente usato è CDCl3 a meno che non venga diversamente specificato. Nell‟assegnazione degli spettri
NMR la notazione [ch] indica gli atomi (di C e di H) della catena alchilica posta in posizione 7a per i derivati 86, 88, 89 dell‟allilossazolidinone 70 e in posizione 2 per i derivati 90-95 dell‟N-Boc- allilprolina (71) ed i corrispondenti prodotti ridotti 97-102. La notazione [Glc], invece, indica gli atomi (di C e di H) del residuo glucosilato nel prodotto 94 e nel corrispondente prodotto idrogenato 101. Gli spettri di massa sono stati registrati a 70 eV per iniezione diretta con uno strumento GC-MS Carlo Erba QMD 1000. Le misure di potere ottico rotatorio sono state effettuate con un polarimetro Perkin Elmer 240 C. I punti di fusione (p.f.) sono stati determinati con un apparecchio Bűchi 510.Le purificazioni dei prodotti sono state effettuate per via cromatografica mediante FCC (flash column chromatography) su gel di silice 32-63 Mesch. I valori di Rf si riferiscono a quelli ottenuti da TLC impiegando fogli di gel di silice dello spessore di 0.25
mm (Merk F254); la rivelazione delle macchie è stata effettuata con una lampada U.V. (274 nm), con rivelatori p-anisaldeide o permanganato. Le analisi elementari sono state effettuate con un analizzatore Perkin-Elmer 2400. Tutte le reazioni che richiedevano condizioni anidre sono state effettuate in atmosfera di azoto utilizzando solventi distillati prima dell‟uso: THF su Na e benzofenone, CH2Cl2 su CaH2, Et2O su LiAlH4, CH3CN su CaH2, iPr2NH su KOH, MeOH su
CaH2.