Produzione di enzimi ligninolitici su suolo contaminato ad hoc

Nel corso delle prove sono state dosate le attività di alcuni enzimi extracellulari ligninolitici potenzialmente coinvolti nella degradazione degli IPA nel suolo modello contaminato ad hoc in laboratorio.

Lo spettro delle attività enzimatiche prodotte dai ceppi Pleurotus ostratus e Irpex lacteus impiegati in questo studio è ampiamente descritto in letteratura (Shah e Nerud, 2002; Hammel, 1995; Novotny et al., 2000). Il primo è noto per essere un buon produttore di laccasi, manganese perossidasi e aril-alcool ossidasi (AAO). La AAO viene prodotta nel corso del metabolismo secondario e assolve alla duplice funzione di fornire perossido di idrogeno per il funzionamento delle perossidasi nonché di evitare la ripolimerizzazione di specie radicaliche. I. lacteus, oltre agli enzimi sopra menzionati, produce anche lignina perossidasi.

I due ceppi isolati nel suolo contaminato, Phlebia sp. e Allescheriella sp., sono stati precedentemente testati in cultura agitata su diversi terreni di coltura al fine di caratterizzare i ceppi per quanto riguarda il loro spettro enzimatico (D’Annibale et al., 2006). La laccasi è stato l’unico enzima ligninolitico prodotto in cultura agitata da entrambi i ceppi, mentre nei suoli storicamente contaminati dai quali sono stati isolati e successivamente sottoposti a micorisanamento sono stati rilevati enzimi lignina perossidasi e manganese perossidasi.

In Tabella 4.14 sono riportate le produzioni di enzimi ligninolitici riscontrate su suolo in assenza ed in presenza di agenti mobilizzanti al termine del periodo di incubazione con I. lacteus. In generale, indipendentemente dalle condizioni, non è stata riscontrata né attività lignina perossidasica né aril-alcool ossidasica. Inoltre, i livelli più elevati di produzione enzimatica sono stati rilevati in assenza di additivi, in particolare per quanto concerne l’attività manganese perossidasica (217 mUI/g suolo) e quella laccasica (26,8 mIU/g suolo).

Le attività ligninolitiche su suolo colonizzato da P. ostreatus risultavano in generale superiori a quelle rilevate con I. lacteus. Anche in questo caso, le attività più alte si ottenevano in assenza di additivi, fatta esclusione per i suoli contenenti Tween 80 che esibivano livelli di attività enzimatiche comparabili al controllo (Tabella 4.15).

Tabella 4.14 Attività enzimatiche ligninolitiche e proteine solubili rilevate al termine del biotrattamento (6 settimane a 28°C) con Irpex lacteus

in assenza e in presenza degli agenti mobilizzanti.

Attività enzimatiche (mUI/g suolo) Proteine solubili (µg/g suolo) Agente mobilizzante

Laccasi Mn-perossidas Ligninasi Aril-alcool

Ossidasi Tirosinasi DMP ABTS Nessuno 26,8 ± 2,2 a _{2,2 ± 0,3} a _{217,0 ± 35,1} a _n.r a _n.r a _n.r a _{0,86 ± 0,0} a Olio soia 8,2 ± 4,1 b _{5,0± 1,0} b _n.r b _n.r a _n.r a _n.r a _{0,65 ± 0,0} a Tween 20 6,0 ± 1,2 b _{1,5± 0,2} a _n.r b _n.r a _n.r a _n.r a _{0,82 ± 0,1} a Tween 80 12,1 ± 2,3 b _{2,2± 0,4} a _{50,5 ± 10,8} c _n.r a _n.r a _{1,0 ± 0,2} a _{0,70 ± 0,1} a AV 18,1 ± 1,2 a _{1,0± 0,3} a _n.r b _n.r a _n.r a _{5,35 ± 1,2} b _{0,85 ± 0,0} a RAMEB 15,1 ± 3,3 b _{2,6± 0,1} a _n.r b _n.r a _n.r a _{4,4 ± 0,9} b _{0,94 ± 0,2} a

Legenda: n.r., non rilevata, DMF, 2,6 dimetossifenolo; ABTS, 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazoline-6-sulfonato).

I dati sono media ± d.s. di tre repliche.

L’effetto degli agenti mobilizzanti è stato analizzato statisticamente all’interno della colonna: valori sovrastati da lettere uguali indicano assenza di significatività come determinato mediante il test di Tukey (P ≤ 0,05).

Tabella 4.15 Attività enzimatiche ligninolitiche e proteine solubili rilevate al termine del biotrattamento (6 settimane a 28°C) con Pleurotus ostreatus in assenza (controllo) e presenza degli agenti mobilizzanti.

Attività enzimatiche (mUI/g suolo) Proteine solubili (µg/g suolo) Agente Mobilizzante

Laccasi Mn-perossidas Ligninasi Aril-alcool

Ossidasi Tirosinas DMP ABTS Nessuno 25,3 ± 6,0 a _{6,7 ± 0,2} ab _{498,8 ± 30,7} a _n.r. a _n.r. a _n.r a _{0,64 ± 0,0} a Olio soia 7,7 ± 1,6 b _{3,6 ± 0,7} a _n.r. b _n.r. a _n.r. a _n.r a _{0,56 ± 0,1} a Tween 20 15,2 ± 6,5 ba _{12,3 ± 3,2} bc _n.r. b _n.r. a _n.r. a _n.r a _{0,64 ± 0,0} a Tween 80 26,1 ± 3,4 a _{15,7 ± 3,1} c _{513,7 ± 92,7} a _n.r. a _n.r. a _{1,4 ±0,3} b _{0,74 ± 0,0} a AV 10,2 ± 0,0 b 11,9 ± 3,4 bc _n.r. b _n.r. a _n.r. a _n.r a _{0,80 ± 0,1} a RAMEB 9,6 ± 2,5 b _{7,5 ± 3,8} ab _n.r. b _n.r. a _n.r. a _{2,6 ±0,2} c _{0,78 ± 0,1} a

Legenda: n.r., non rilevata, DMF, 2,6 dimetossifenolo; ABTS, 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazoline-6-sulfonato).

I dati sono media ± d.s. di tre repliche.

L’effetto degli agenti mobilizzanti è stato analizzato statisticamente all’interno della colonna: valori sovrastati da lettere uguali indicano assenza di significatività come determinato mediante il test di Tukey (P ≤ 0,05).

In Tabella 4.16 sono riportati i valori di tali attività riscontrate su suolo in assenza ed in presenza di agenti mobilizzanti al termine del periodo di incubazione con Phlebia sp.

Tra queste, la più rilevante da un punto di vista quantitativo era quella MnP-asica, che risultava peraltro stimolata rispetto al controllo nei suoli contenenti Tween 20 (549,8 mUI/g suolo) e AV (494,0 mUI/g suolo).

La presenza di agenti mobilizzanti, invece, non determinava aumenti significativi nei livelli di attività laccasica di Phlebia sp. rispetto a quelli rilevati in assenza dei additivi stessi. Anche l’attività ligninasica veniva stimolata significativamente dalla presenza del Tween 80, delle AV e delle RAMEB. Le attività aril-alcool ossidasica e tirosinasica, che non venivano rilevate nei suoli in assenza di pretrattamento, risultavano essere elicitate dalla presenza di Tween, AV e ciclodestrine metilate.

Nelle prove condotte con Allescheriella sp. si riscontravano, in assenza degli agenti mobilizzanti, dei livelli di attività laccasica e ligninasica (Tabella 4.17) nettamente inferiori a quelli registrati con Phlebia sp. nelle stesse condizioni. Inoltre, in assenza di pretrattamento non venivano rilevate attività MnP-asica, ligninasica, tirosinasica e aril-alcool ossidasica. Tra gli agenti sottoposti ad indagine, il più efficiente nello stimolare la produzione di enzimi ligninolitici era il Tween 20: in particolare, l’attività laccasica, presenta anche nel controllo, veniva incrementata di un fattore pari a circa 11, inoltre, si riscontravano significativi livelli di attività MnP-asica, ligninasica e tirosinasica (69,8, 59,5 e 42,6 mUI/g suolo, rispettivamente). Per quanto riguarda il Tween 20, vale la pena di ricordare che esso esercita un effetto stimolante sul rilascio di diversi enzimi extracellulari (Katic et al., 1998; Urek e Pazarlioglu, 2005) e questo è in linea con quanto precedentemente riportato per Allescheriella sp., sia per quanto riguarda le prestazioni degradative, sia per quanto concerne la stimolazione della produzione di attività ligninolitiche.

Le Tabelle 4.16 e 4.17 mostrano chiaramente che i livelli di attività enzimatica più elevati per quanto concerne gli enzimi ligninolitici erano quelli relativi alla manganese perossidasi. Si può notare inoltre, che l’attività MnP-asica più alta si otteneva nei suoli non pretrattati o pretrattati con i Tween.

Per quanto riguarda il Tween 80, è noto che esso esercita un effetto stimolante sul rilascio di diversi enzimi extracellulari (Katic et al., 1998; Urek e Pazarlioglu, 2005). E’ stato riportato, inoltre, che il Tween 80, in virtù del suo contenuto in catene aciliche mono-insature suscettibili all’azione della manganese perossidasi, è in grado di stimolare la degradazione del fenantrene e del fluorene da parte del fungo Phanerochaete chrysosporium (Moen e

Hammel, 1994; Bogan et al., 1996). Infatti, il Mn3+ generato enzimaticamente è in grado di attaccare acidi grassi insaturi o lipidi contenenti catene aciliche insature formando radicali idroperossido, i quali sono in grado, a loro volta, di ossidare alcuni IPA (Dix et al., 1985).

In ogni caso, non va trascurato il fatto che un utilizzo del Tween 80 al fine di generare perossi-radicali avrebbe presupposto l’aggiunta concomitante di Mn2+ e, possibilmente, di composti in grado di stabilizzare il Mn3+ da esso derivato, quali acidi organici (Hofrichter, 2002).

In questo studio, la laccasi è stata rilevata in tutte le condizioni sottoposte ad indagine con livelli di attività oscillanti tra 0,5 e 27 mUI/g di suolo. Il coinvolgimento di questo enzima nell’ossidazione degli IPA è noto dalla letteratura scientifica. In particolare, è stato mostrato come la laccasi sia in grado di ossidare un’ampia gamma di IPA ad eccezione del naftalene, del fenantrene e del fluorene persino in assenza di mediatori redox (Majcherczyk et al., 1998) dando luogo alla formazione dei dioni derivati (Majcherczyk et al., 1998).

L’efficienza di ossidazione degli IPA da parte della laccasi viene ad essere notevolmente aumentata in presenza di alcuni mediatori sintetici, quali N- idrossibenzotriazolo (HBT) (Bohmer et al., 1998), o naturali come nel caso dell’acido 4- idrossibenzoico (Johannes e Majcherczyk, 2000). E’ stato inoltre mostrato come l’efficienza di ossidazione degli IPA da parte del sistema laccasi/HBT non sia strettamente correlato al potenziale di ionizzazione (IP) né tantomeno al potenziale di semi-onda degli IPA stessi (Majcherczyk et al., 1998). Tale correlazione con l’IP era stata, invece, segnalata nell’ossidazione degli IPA da parte della lignina perossidasi (LiP) di P. chrysosporium (Bogan e Lamar, 1995). Inoltre, era stato suggerito che gli IPA con IP > 7.55 eV non fossero suscettibili all’azione ossidativa della LiP e della MnP (Bogan e Lamar, 1995).

Nel nostro studio, non è stata trovata alcuna correlazione tra i livelli di deplezione degli IPA e il loro IP. Non è stata inoltre riscontrata alcuna significativa correlazione rapportando i livelli di attività dei singoli enzimi o quelli cumulativi all’entità della deplezione degli IPA. Questo può essere giustificato tenendo presente che la metabolizzazione degli IPA da parte dei funghi white-rot è un processo sinergico che coinvolge altri tipi di enzimi a localizzazione intra-cellulare, quali citocromo P-450 mono- ossigenasi e epossido idrolasi (Bezalel et al., 1997; Cameron et al., 2000).

Tabella 4.16 Attività enzimatiche ligninolitiche e proteine solubili rilevate al termine del biotrattamento (6 settimane a 28°C) con Phlebia sp. in

assenza e in presenza degli agenti mobilizzanti.

Attività enzimatiche (mUI/g suolo) Proteine solubili (µg/g suolo) Agente mobilizzante

Laccasi Mn-perossidasi Ligninasi Aril-alcool

Ossidasi Tirosinasi DMF ABTS Nessuno 6,35 ±0,7a _{8,37 ± 4,5}a _{234,52± 19,3}a _29,82±3,5a _n.r.a _n.r.a _0,17±0,0a Olio soia 6,79± 1,3a _{8,22± 3,4}a _253,32±30,0a _73,41±14,1ab _n.r.a _n.r.a _0,18±0,0a Tween 20 8,91± 0,1a _{13,62± 0,4}a _549,85±5,3b _{n.r. n.r}a_{. 1,45±0,5}a _0,25±0,0a Tween 80 8,20 ±2,4a _{9,69± 0,1}a _{112,61 ± 9,0}c _{116,45 ± 8,9}cb _{42,15± 13,7}a _0,66±0,0a _0,33±0,1a AV 9,29± 5,0a _9,31±1,2a _494,04±0,7b _{88,17± 22,4}cb _n.r.a _1,48±0,7a _1,49±1,2b RAMEB 13,99±5,1a _{10,20± 2,6}a _235,32±45,3a _{80,52± 5,2}cb _{11,72± 1,9}b _1,45±0,8a _0,35±0,1a

Legenda: n.r., non rilevata, DMF, 2,6 dimetossifenolo; ABTS, 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazoline-6-sulfonato).

I dati sono media ± d.s. di tre repliche.

L’effetto degli agenti mobilizzanti è stato analizzato statisticamente all’interno della colonna: valori sovrastati da lettere uguali indicano assenza di significatività come determinato mediante il test di Tukey (P ≤ 0,05).

Tabella 4.17 Attività enzimatiche ligninolitiche e proteine solubili rilevate al termine del biotrattamento (6 settimane a 28°C) con Allescheriella sp. in assenza e in presenza degli agenti mobilizzanti.

Attività enzimatiche (mUI/g suolo) Proteine solubili (µg/g suolo) Agente mobilizzante

Laccasi Mn-perossidasi Ligninasi Aril-ailcool

ossidasi Tirosinasi DMF ABTS Nessuno 0,48 ±0,3a _{1,49± 0,3}a _n.r.a _n.r.a _n.r.a _n.r.a _0,16±0,0a Olio soia 6,15±0,3a _0,77±0,3a _n.r.a _n.r.a _n.r.a _n.r.a _0,21±0,1a Tween 20 6,35±3,4a _1,69±0,05a _69,83±29,0a _59,52±3,7a _42,62±17,7a _n.r.a _0,25±0,1a Tween 80 1,38 ±0,2a _1,76±0,3a _n.r.a _21,41±6,7b _n.r.a _n.r.a _0,28±0,0a AV 20,91±6,6b _24,65±4,3b _n.r.a _n.r.a _n.r.a _n.r.a _0,79±0,3a RAMEB n.r.a 3,25±0,3a _202,47±51,5b _n.r.a _n.r.a _2,60±0,2a _0,65±0,1a

Legenda: n.r., non rilevata, DMF, 2,6 dimetossifenolo; ABTS, 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazoline-6-sulfonato).

I dati sono media ± d.s. di tre repliche.

L’effetto degli agenti mobilizzanti è stato analizzato statisticamente all’interno della colonna: valori sovrastati da lettere uguali indicano assenza di significatività come determinato mediante il test di Tukey (P ≤ 0,05).