Numerosi fattori molecolari che regolano il ciclo cellulare, la trasduzione del segnale e la trascrizione esibiscono una sensibilità più o meno marcata per le modificazioni ossido-riduttive.
Molti fattori di trascrizione, ad esempio, possiedono residui di cisteina conservati che li rendono responsivi in particolari condizioni ossido-riduttive della cellula o che permettono di sentire i livelli di molecole segnale coinvolte nella segnalazione redox (Na and Surh, 2006). OxyR è il primo esempio di fattore di trascrizione, la cui attività è regolata dalle condizioni pro-ossidanti, ad essere stato identificato nei procarioti. L’esposizione ad elevati livalli di H2O2 comporta l’attivazione del fattore, per effetto della
formazione di un ponte disolfuro tra le cys199 e cys208. Il cambiamento conformazionale è associato ad un’ aumentata affinità per il DNA e al reclutamento della RNA polimerasi (Filomeni et al., 2005a). Esiste poi una regolazione redox del fattore più fine, di recente messa in evidenza dal gruppo di Stamler. La cys199 è il residuo critico in questo tipo di regolazione che affianca lo switch on/off descritto in precedenza. Questa cisteina può andare incontro a gradi successivi di ossidazione, in funzione dello squilibrio redox presente nell’ambiente intracellulare e dalla natura delle specie pro-ossidanti presenti. La S-nitrosilazione, la S-glutatiolazione, la formazione del ponte disolfuro e l’ossidazone ad acido sulfenico possono essere alternativamente utilizzati per regolare finemente l’attività trascrizionale della proteina (Kim et al., 2002).
Negli eucarioti, inoltre, la regolazione redox basata sulla durata e sulla intensità dello stimolo viene ulteriormente complicata dal confinamento spaziale della regolazione di molti fattori di trascrizione (Filomeni et al., 2005a).
Nrf2 (Nuclear factor erythroid 2-Related Factor 2)
Il fattore di trascrizione Nrf2 rappresenta un ottimo esempio di regolazione spaziale dell’attività trascrizionale operata attraverso stimoli di tipo ossidativo. Nrf2 dirige la trascrizione di geni che contengono nel proprio promotore l’elemento ARE (Antioxidant Response Element), si tratta di proteine la cui espressione può essere indotta in condizioni di stress ossidativo. Tra di esse è possibile annoverare enzimi con funzione
citoprotettiva quali la NAD(P)H:quinone ossido reduttasi 1 e la glutatione-S- transferasi importanti per la detossificazione di carcinogeni; enzimi antiossidanti quali la superossido dismutasi e l’eme-ossigenasi 1 (HO-1) ed infine enzimi che regolano lo stato riducente dell’ambiente intracellulare quali la glucosio 6-fosfato deidrogenasi, essenziale alla produzione del NADPH (Eggler et al., 2008).
In assenza di stimoli in grado di evocare la risposta antiossidante, il fattore è localizzato a livello citosolico dove interagisce con la proteina Keap1. Il suo interattore ne garantisce l’esclusione dal nucleo e, in quanto adattatore molecolare per il complesso dell’ubiquitina ligasi, ne permette la degradazione e il rapido turn-over (Fig.7).
Figura 7
Meccanismo di attivazione del fattore di trascrizione Nrf2
Lo schema illustra l’attivazione trascrizionale di Nrf2 mediata da ossidanti e garantita dalla perdita del legame con l’interattore Keap1.
Dopo il 2002 un numero crescente di informazioni sono andate ad accumularsi per spiegare il meccanismo di attivazione di Nrf2 in risposta a stress di tipo ossidativo ed attualmente esistono due modelli che la descrivono.
Il primo modello prevede una ridotta ubiquitinazione del fattore, per effetto della perdita dell’interazione con Keap1. Ossidazioni a carico di Keap1, proteina particolarmente ricca in cisteine, potrebbero comportare non direttamente tale perdita, ma in maniera più plausibile una alterazione del ruolo funzionale di Keap1 come adattatore molecolare per l’ubiquitina ligasi. Questa ipotesi è supportata dal fatto che molti attivatori, tra cui
numerose molecole di derivazione alimentare, che potrebbero essere impiegate nella protezione da carcinogeni, quali la quercetina, il sulforafano, il trisolfuro di diallile, la ginesteina e la curcumina, possiedono gruppi elettrofilici in grado di reagire con sulfidrili proteici (Eggler et al., 2008). Inoltre esisterebbe un ruolo regolatorio anche per fosforilazioni a carico di Nrf2 ed in particolare la chinasi p38MAPK sarebbe in grado di determinare una
fosforilazione che rafforzerebbe l’interazione Nrf2-Keap1, inibendo la risposta antiossidante (Keum et al., 2006).
Secondo l’altro modello, invece, i processi di importo ed esporto dal nucleo giocherebbero un ruolo preponderante nell’attivazione trascrizionale di Nrf2. Tali meccanismi sarebbero regolati da processi di fosforilazione, e anche ossidazione di cisteine a carico del fattore di trascrizione. Per quanto concerne i processi di fosforilazione la fofatidilinositolo-3 chinasi (PI3K) sarebbe responsabile dell’accumulo nuclerare di Nrf2 (Martin et al., 2004). L’ossidazione della cys183, localizzata in una sequenza di esporto nucleare, sembra essere, invece, essenziale a ridurre l’esporto del fattore dal nucleo e a garantirne, pertanto, l’attività trascrizionale in condizioni di stress ossidativo (Li et al., 2006).
p53
Il soppressore tumorale p53 è coinvolto nella risposta cellulare a numerose tipologie di stress ed in particolare a stress di natura genotossica, garantendo la trascrizione di geni coinvolti nel riparo, nell’arresto del ciclo cellulare, nella senescenza e nell’induzione dell’apoptosi (Liu and Chen, 2006). In condizioni fisiologiche anche p53 possiede un’emivita breve, per cui i suoi livelli sono mantenuti molto bassi dall’interazione con l’ubiquitina ligasi Mdm2 (Haupt et al., 1997). La scoperta che l’overespressione di p53 si accompagna alla transattivazione di geni che codificano per proteine con attività redox tra cui la NAD(P)H:quinone ossido reduttasi 1 ha permesso di stabilire per la prima volta un chiaro nesso tra ROS e p53 (Polyak et al., 1997). A differenza del ruolo pro-ossidante svolto dagli aumentati livelli di p53, a livelli basali il fattore svolge un’azione volta a contenere i fisiologici livelli dei ROS entro limiti di non tossicità, essenzialmente attraverso l’attivazione di geni per proteine antiossidanti (Sablina et al., 2005). Peraltro l’interazione tra il fattore di trascrizione e i ROS intracellulari si esplica non solo attraverso la fine regolazione di vie di segnalazione redox-sensibili, ma anche attraverso una diretta modificazione operata dai ROS, per effetto delle numerose cisteine modificabili che possiede il fattore (Liu et al., 2008).
Un meccanismo di recente proposto per giustificare l’azione su cisteine di proteine che legano il DNA prevede un’azione diretta degli elettroni che, a partire dalla formazione di radicali guaninici, possono essere trasportati lungo le coppie di basi aromatiche che formano la doppia elica di DNA (Merino et al., 2008).
Figura 8
Meccanismi di trasporto di carica nel contesto biologico
Il trasporto di carica lungo la doppia elica di DNA svolge molteplici funzioni: dal convogliamento del danno ossidativo su regioni regolatorie e non codificanti del DNA alla mediazione della segnalazione su proteine coinvolte nel riparo e nella regolazione trascrizionale.
Questa modalità di regolazione, descritta in Fig. 8, ha trovato una prima conferma per il fattore p53. Secondo il modello i radicali guaninici vengono generati per effetto dell’azione pro-ossidante di specifici composti e se i loro livelli sono sufficienti ad innescare il trasporto di carica lungo la doppia elica di DNA andrebbero ad ossidare cisteine sensibili di alcuni fattori di trascrizione determinando il rilascio dalla regione del promotore di geni impedendono la trascrizione. Il meccanismo sembra essere coinvolto nella inibizione della trascrizione di geni coinvolti nei processi di riparo, qualora il danno al DNA sia tale da rendere futile il riparo stesso (Merino et al., 2008).
La tioredossina
La tioredossina (Trx1) è una proteina ubiquitaria di 12 kDa che possiede un’attività ossidoreduttasica essenziale per il corretto ripiegamento delle proteine e per garantire l’attività di particolari enzimi quali la ribonucleotide reduttasi e la protein disolfuro isomerasi, nonché il corretto legame di alcuni fattori di trascrizione al DNA tra cui p53, NF-κB e AP1 (Filomeni et al., 2003).
Il sistema è altresì importante come donatore di idrogenioni per molte perossiredossine, coinvolte nella riduzione di perossidi (Filomeni et al., 2003; Nordberg and Arnér, 2001). La tioredossina è in grado di formare ponti disolfuro, usualmente intermolecolari, la cui riduzione è a carico della tioredossina reduttasi, che utilizza come fonte di elettroni l’NADPH. Le conoscenze sulla chimica della Trx1 hanno fatto numerosi passi in avanti negli ultimi dieci anni, grazie alla messa a punto di metodi di analisi, nonché ai progressi condotti in campo biochimico, molecolare e nella biologia strutturale. Questo fattore, originariamente identificato da Peter Reichard come donatore di elettroni della ribonucleotide reduttasi in Escherichia coli, possiede un ditiolo caratteristico a livello del sito attivo, che oggi sappiamo essere altamente conservato a livello evolutivo (Lillig and Holmgren, 2007). Il meccanismo di reazione della proteina è descritto nella fig. 9.
Figura 9
Meccanismo di reazione della tioredossina
Esso richiede le due cisteine del sito attivo in forma ridotta. La Trx si lega in maniera non covalente al disolfuro proteico da ridurre attraverso la superficie idrofobica che circonda il sito attivo. La cisteina all’N-terminale (cys32) effettua un attacco nucleofilo del disolfuro target, formando un intermedio di reazione in cui la Trx e la proteina sono legate da un ponte disolfuro, poi ridotto dalla cisteina al C-terminale del sito attivo (cys35).Il sito attivo ossidato è quindi nuovamente ridotto dalla tioredossina reduttasi (TrxR), in una reazione NADPH dipendente. Le cellule di mammifero contengono due distinte tioredossine: la Trx1, prevalentemente citosolica,e la Trx2, localizzata nei mitocondri. Il gene per la Trx1 è organizzato in cinque esoni separati da quattro introni ed è caratterizzato dalla presenza di due promotori, parzialmente sovrapposti, contenenti numerosi elementi per l’espressione costitutiva del gene e per quella inducibile. Tra gli elementi di regolazione responsabili della trascrizione indotta è di particolare importanza menzionare l’elemento di risposta antiossidante (ARE) per l’induzione in condizioni di stress ossidativo (Kim et al., 2003).
A differenza della controparte procariotica, le tioredossine negli eucarioti possiedono delle cisteine addizionali e per ognuna di esse è stato suggerito un ruolo regolatorio nell’attività della proteina (fig. 7).
Un secondo ponte disolfuro tra la cys62 e la cys69 è stato identificato mediante spettrometria di massa (Watson et al., 2003), si tratta di un ponte disolfuro che non può essere ridotto dalla TrxR e che ha la capacità di ridurre la velocità con cui la reduttasi riattiva il sito attivo della proteina. Inoltre il processo di S-nitrosilazione, che coinvolge la cys69, sembra essere coinvolto nella preservazione dell’attività redox della Trx1 in condizioni di intenso stress ossidativo (Haendeler et al., 2002). Anche la cys73, che nella struttura tridimensionale è in prossimità del sito attivo, può essere S- nitrosilata e questa modificazione può garantire il trasferimento della molecola di NO alla cisteina del sito catalitico della caspasi 3, regolandone l’attività catalitica (Mitchell and Marletta, 2005) (Fig. 10).
Figura 10
Struttura tridimensionale della Trx1 in cui vengono mostrati i residui di cisteina
La proteina contiene, negli eucarioti, tre residui di cys addizionali, tutti coinvolti in processi regolatori: la cys62 e la cys69 possono formare un ponte disolfuro, la cys69 e la 73 possono andare incontro a S-nitrosilazione e la cys73 può essere S-glutatiolata e dare luogo alla formazione di dimeri tra due molecole di Trx1.
La tioredossina nei tumori gastrici
Gli elevati livelli di proteine con attività ossidoreduttasica possono rappresentare una prima risposta adattativa al fenomeno dello stress ossidativo implicato nel processo di tumorigenesi. L’originaria osservazione dell’attività mitogenica che la Trx1 è in grado di esercitare su cellule leucocitarie è oggi supportata da conoscenze relative all’azione regolativa che essa esercita sui processi proliferativi. La sua espressione è elevata in molti tipi tumorali e correla con la resistenza a chemioterapici classici quali il cisplatino, la mitomicina C, la doxorubicina e l’etoposide (Yokomizo et
al., 1995). Inoltre è stata osservata una relazione diretta fra i livelli di
espressione della Trx1 e la progressione nonché la cattiva prognosi di alcuni tipi di tumore, tra cui i tumori polmonari (Kaimul et al., 2007). Alcuni studi hanno inoltre messo in evidenza una correlazione tra l’espressione della proteina e l’aumentato tasso proliferativo di carcinomi gastrici (Grogan et
al., 2000). E’ stata inoltre caratterizzata une relazione tra le diverse tipologie
di tumori gastrici e i livelli di espressione della proteina supportando una massima espressione della stessa nelle tipologie indifferenziate di cancro gastrico. Il vantaggio selettivo delle cellule tumorali gastriche overesprimenti la tioredossina è stato associato, in uno studio condotto su topi inoculati con tali cellule, all’azione diretta della proteina come fattore di crescita, nonché alla sua attività inibitoria su vie di induzione dell’apoptosi (Noda et al., 2000).