Protocollo sperimentale

Nel presente lavoro sono state incluse un totale di 24 bovine, 8 primipare e 16 pluripare (2a alla 6a lattazione). Su tutti gli animali sono state eseguite le seguenti procedure a cadenza settimanale, tra i 20 e i 60 giorni PP:

1) Esami per diagnosi di mastite;

2) Valutazione clinica ed ecografica apparato riproduttore: eseguita mediante controlli ecografici in concomitanza con campionamento del latte, ponendo particolare attenzione alla presenza di quadri patologici di utero ed ovaie e valutazione della corretta involuzione uterina.

1) Esami per diagnosi di mastite: i campioni di latte sono stati raccolti in fase di pre- mungitura nel pomeriggio, più comodo per organizzazione di allevamento e di laboratori. Mammella e capezzolo sono stati lavati con acqua corrente ed asciugati accuratamente quindi è stato effettuato il CMT (De Laval Spa, San Donato Milanese, MI, Italia) per ogni quarto mammario dopo l’eliminazione dei primi getti di latte al fine di ridurre la flora batterica (Scott et al., 2011). Per ogni quarto positivo al CMT è stato eseguito un campionamento per la valutazione della conta cellule somatiche (CCS): campione raccolto in un contenitore di PVC sterile con conservante (sodio azide) e valutato con metodo fluoro-opto-elettronico a cella di flusso mediante FossomaticTM FC (Foss Italia, Padova).

2) Valutazione clinica ed ecografica apparato riproduttore: l’esame clinico è stato effettuato mediante palpazione di utero ed ovaie e dopo un eventuale riposizionamento uterino, attraverso una trazione dorso-caudale della cervice in modo da rendere superficiali le strutture anatomiche oggetto di studio e favorirne la successiva visualizzazione ecografica. L’esame ecografico, è stato effettuato con ecografo portatile Mindray DP 30 (Cina) e sonda lineare 50L60EAV multifrequenza 4-6 MHz. Tutte le immagini sono state archiviate su pennetta USB e scaricate su un computer fisso.

Dati raccolti:

- Mappatura follicolare con valutazione degli eventuali reperti patologici riscontrati;

- Scansione del corpo e delle corna uterine con particolare interesse nel rilevamento di patologie quali endometrite, metrite e valutazione della presenza di liquido.

- Misurazione dello spessore uterino utilizzando come punto di repere la parte del corpo dell’ utero antecedente alla cervice (immagine 7.1).

Immagine 7.1: Misurazione del diametro del corpo uterino nella porzione antecedente alla cervice.

I dati relativi alla bovina e quelli rilevati mediante la valutazione ecografica sono stati riportati su schede cartacee (tab. 7.2):

N.ro aziendale identificativo dell’animale, riportato su marca auricolare. Data parto giorno in cui la vacca ha partorito.

gg PP-visita n.ro di giorni da parto a prima visita ginecologica. N.ro ecografie n.ro di ecografie effettuata su ciascun animale. Ovaio dx e sn reperti ovarici e misurazioni.

Utero misurazione in cm del corpo uterino nella porzione antecedente alla cervice.

Liquido segnalamento della presenza di liquido all’interno dell’utero. Note Eventuali altri eventi fisiologici o patologici di nostro interesse.

Tab. 7.2. Dati sulla bovina e sulle visite ecografiche raccolti per ciascun animale incluso nello studio.

Sulla base della CCS le bovine sono state suddivise retrospettivamente in due gruppi: - Mastitiche (n=12): bovine che presentavano almeno un quarto positivo al

CMT e con CCS ≥200.000 cell/ml (Sharma et al., 2011);

- Sane (n=12): bovine sempre negative al CMT e con CCS nella norma (Sharma et al., 2011).

Sulla base del numero di parti, le bovine sono state suddivise retrospettivamente in: - Primipare (n=8): soggetti in prima lattazione;

- Pluripare (n=16): soggetti dalla seconda lattazione.

Analisi statistica

Per lo studio abbiamo preso in esame: • Il diametro utero;

• N.ro inseminazioni necessarie per ottenere una gravidanza; • N.ro gg tra parto e prima inseminazione;

• Numero dei “giorni open”.

I dati sono stati espressi come media±deviazione standard. E’ stata valutata la loro distribuzione mediante il test Kolmogorov-Smirnov che è risultata gaussiana. Sono stati, quindi, applicati t-test per dati parametrici non appaiati per valutare le

differenze fra gruppo pluripare vs primipare e fra gruppo mastitiche vs sane per il numero di inseminazioni necessarie per ottenere una gravidanza, n.ro gg tra parto e prima inseminazione e il numero di “giorni open”. Le differenze sono state considerate statisticamente significative per p<0,05.

E’ stata inoltre calcolata la regressione lineare per valutare la variazione del diametro dell’utero nel tempo in bovine: primipare, pluripare, mastitiche e sane. Sono state calcolate le differenze tra pendenze e intercette delle rette di regressione eseguite tra primipare vs pluripare e tra mastitiche vs sane, al fine di valutarne eventuali differenze.

Anche in questo caso la significatività è stata settata per p<0,05. L’analisi statistica è stata effettuata mediante l’utilizzo di un software commerciale (GraphPad Prism 6.0, USA).

7.4 Risultati

L’esame clinico non ha evidenziato in alcuna bovina scolo vaginale muco-purulento riconducibile a metrite-endometrite. Gli esami ecografici non hanno evidenziato cisti ovariche e/o accumulo di liquido patologico in utero.

L’intervallo parto prima inseminazione, parto concepimento, e il numero di inseminazioni necessarie al concepimento, nelle bovine rispettivamente divise in mastitiche e sane o pluripare e primipare, sono riportati nelle tabelle 7.3 e 7.4.

Non sono state evidenziate differenze statisticamente significative fra il gruppo di vacche mastitiche vs sane per il numero di inseminazioni necessarie per il concepimento (P=0,9472), al contrario lo stesso parametro analizzato fra il gruppo di vacche primipare vs pluripare ha evidenziato differenze statisticamente significative (P=0,0362) con un numero maggiore di interventi fecondativi necessario per concepimento negli animali pluripari (3,9±0,47 interventi) rispetto alle vacche primipare (1,6±0,3 interventi).

Nessuna differenza statisticamente significativa fra il gruppo di vacche affette da mastite vs le sane (P=0,97) e il gruppo di vacche pluripare vs le primipare (P=0.38) per il momento della prima inseminazione calcolato in giorni PP.

Per l’analisi statistica del numero dei “giorni open” non è stata evidenziata nessuna differenza statisticamente significativa fra il gruppo di vacche mastitiche vs sane (P=0,57) e fra il gruppo di vacche pluripare vs primipare (P=0,87).

La regressione lineare ha evidenziato una involuzione significativa del diametro uterino con andamento negativo per:

- Sane (r=0,1708; slope= -0,2107±0,08772); - Primipare (r=0,1648; slope= -0,1843±0,08138); - Pluripare (r=0,0007379; slope=-0,1149±0,06041).

Non è stata evidenziata involuzione uterina nel tempo invece per le bovine mastitiche (r=0,02614; slope=0,06431±0,05986).

Sono state osservate delle differenze statisticamente significative per la pendenza e l’intercetta delle rette di regressione tra diametro del corpo uterino nel tempo tra mastitiche e sane, ma non tra primipare e pluripare (Grafico 7.1 e 7.2).

Nelle tabelle 7.5 e 7.6 è riportato l’andamento settimanale del diametro uterino espresso come media ± deviazione standard nei quattro gruppi.

Primipare Pluripare P 1° I.A. (gg PP) 76,57±6,22 66,64±7,23 NS N° I.A./concepimento 1,66±0,33* 3,90±0,47* 0,0362

Giorni open 110,00±25,16 116,9±24,14 NS

Tabella 7.3. Risultati relativi al numero di inseminazioni necessarie per il concepimento (N° I.A./concepimento), prima inseminazione eseguita calcolata in gg PP (1° I.A.-gg PP) e giorni open nei due gruppi primipare e pluripare.

Sane Mastitiche P

1° I.A. (gg PP) 69,83±5,24 70,11±10,53 NS N° I.A./concepimento 2,11±0,58 2,16±0,47 NS Giorni open 123,9±24,8 101,8±29,31 NS

Tabella 7.4. Risultati relativi a numero di inseminazioni necessarie per il concepimento (N° I.A./concepimento), prima inseminazione eseguita calcolata in gg PP (1° I.A.-gg PP) e giorni open nei due gruppi sane e mastitiche.

Categoria 3° settimana 4° settimana 5° settimana 6° settimana 7° settimana 8° settimana 9° settimana Mastitiche 3,5±0 2,7±0,9 2,7±0,6 2,8±0,6 3,2±0,6 2,0±0,8 3,0±0,4 Sane 3,4±1,9 3,5±1,5 3,3±0,6 2,7±0,5 2,8±0,4 2,5±0,4 2,4±0,7

Tabella 7.5. Risultati relativi alla media ± deviazione standard della misurazione del diametro uterino (mm) nei gruppi di vacche mastitiche e sane dalla terza alla nona settimana PP. Categoria 3° settimana 4° settimana 5° settimana 6° settimana 7° settimana 8° settimana 9° settimana Primipare 2,75±1,06 3,88±0,83 2,88±0,75 2,83±0,29 2,89±0,67 2,42±0,88 2,55±0,96 Pluripare 4,7±0 2,63±1,30 3,04±0,64 2,75±0,56 3,26±0,53 2,90±0,35 2,81±0,49

Tabella 7.6. Risultati relativi alla media ± deviazione standard della misurazione del diametro uterino (mm) nei gruppi di vacche primipare e pluripare dalla terza alla nona settimana PP.

Grafico 7.1: Rappresentazione grafica involuzione uterina tra gruppo animali