Quantificazione delle proteine totali con metodo Bradford

Il metodo rileva la presenza delle proteine attraverso il colorante (Coomassie Brillant Blu) che si lega a residui di aminoacidi basici presenti nelle proteine. Nella determinazione del contenuto proteico è stata inizialmente preparata una curva di calibrazione preparando 5 concentrazioni note di BSA (Albumina Bovina Sierica) con 2, 5, 10, 15, 20 μg/ml, partendo da una stock solution di BSA di 1mg/ml H20. Nelle diverse concentrazioni di BSA (rispettivamente: 2, 5, 10, 15,

20μl), è stata aggiunta H20 distillata e 200μl del Comassie Brillant Blue (G-250,

Biorad) portando a volume totale di 1ml. Per la valutazione della retta di taratura, le concentrazioni, una volta preparate, sono state agitate e poste a riposo per 10 minuti. Per la quantificazione delle proteine dei digeriti gastrici sono state analizzate aliquote di 10 μL per ogni condizione sperimentale. Le soluzioni, come per la curva di calibrazione, sono state ottenute in sequenza unendo l’aliquota del campione, H20 distillata e 200μl del comassie brillant blue, ottenendo 1ml di

volume finale. Le soluzioni sono state agitate e poste a riposo per 10 minuti. La lettura della densità ottica, per curva di calibrazione e campioni, è avvenuta a 595nm tarando lo strumento con una soluzione di 800 μl di H20 distillata e 200 μl

di comassie brillant blue. Il valore del contenuto proteico è stato ottenuto interpolando l’assorbanza del campione nella curva di taratura.

6.9 Elettroforesi SDS-PAGE

digeriti gastrici delle piadine tal quali, utilizzando aliquote di 10μL per ogni campione.

Nell’analisi è stato utilizzato un gel Mini-PROTEAN TGX Macchia-Fee ™ Gel (Biorad, Milano) al 10%.

Come marker dell’analisi è stato utilizzato il Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Standards # (161-0375), preparato con una diluizione 1:10 ed utilizzato nella corsa con un volume di 5 μL.

Il buffer utilizzato era composto da Tris 25mM, Glicina 192mM e SDS (Sodio Dodecil Solfato) 0,1% p/v. L’elettroforesi è stata condotta a 200mV per 20 min.

Dopo elettroforesi le proteine del gel sono state attivate con una esposizione a raggi UV per 5 min, il tutto poi trasferito su di una membrana di nitrocellulosa utilizzando un sistema Turbo Trans-Blot (Biorad, Milano). Per la fluorescenza delle proteine con metodo densitometrico è stato utilizzato uno Chemi Doc MP (Biorad, Milano) utilizzando il software dell’acquisizione dell’immagine Image Lab Rev 4.0.

6.10 Spettrometria al Plasma su HPLC-ICP-MS

Con la collaborazione del Dott. Francesco Cubadda dell’Istituto Superiore di Sanità (ISS) in Roma e del suo staff, sono state effettuate le analisi di speciazione del selenio attraverso l’utilizzo della strumentazione HPLC-ICP-MS (cromatografia liquida ad alta prestazione abbinata a spettrometria di massa a plasma accoppiato induttivamente).

Le Separazioni cromatografiche sono state effettuate utilizzando un HPLC Perkin- Elmer Serie 200 LC con pompa binaria, auto campionatore e colonna termostatata. L'uscita della HPLC, collegato direttamente tramite tubi capillari in PEEK per la nebulizzatore nell’Elan DRC II ICP - MS (Perkin-Elmer-Sciex, USA), permette al rilevatore specifico del selenio di svolgere una quantificazione totale o di effettuare un’analisi di speciazione. Le impostazioni strumentali sono in tabella 16.

Tabella 16: Parametri analisi HPLC-ICP-MS (Poonam Bhatia et al., 2013)

Per la calibrazione della colonna di esclusione cromatografia è stato collegato un Perkin- Elmer DAD (Diod Array Detector) operativo a 280 nm. Per lo svolgimento dell’analisi sono stati utilizzati i seguenti reagenti e standard:

- acqua deionizzata ottenuta da un sistema Milli-Q Element (Millipore, Francia) utilizzato in tutte le fasi del lavoro,

- acido nitrico 68 % v/v (Carlo Erba Reagenti, Italia),

- perossido di idrogeno al 31 % v/v (Merck KGaA, Germania).

Le soluzioni di standard interno (rodio) utilizzati per le misurazioni totali di selenio sono state ottenuti da soluzioni stock certificate con un contenuto di 1 mg / ml (High Purity Standard, USA), diluiti con acidificanti (HNO3) e acqua

Per l'analisi di speciazione, dalla soluzioni stock di 1 mg / ml, espressi in selenio, sono state preparate sciogliendo in acqua sufficienti quantità di acido di selenio Se ( IV ), acido selenico Se (VI) e Seleno-L- metionina (Sigma - Aldrich , USA). Le soluzioni madre degli standard sono state conservati a 4°C e diverse concentrazioni delle stesse sono state accertate mediante analisi ICP -MS. La purezza degli standard è stata controllata mediante HPLC - ICP –MS senza trovare delle interconversioni nelle diverse specie.

Le fasi mobili cromatografiche sono state preparate sciogliendo adeguate quantità analitiche di trietilammina (TEA-Sigma-Aldrich, USA) , acido acetico al 99 % (Baker Instra Analyzed, Avantor Material, Paesi Bassi) e di ammonio acetato (Merck KGaA , Germania) in acqua. Le diverse fasi mobili sono stati filtrati attraverso un Millipore Express Plus con menbrana da 0.22 μm. Per la cromatografia di esclusione sono stati usati cono calibratori, sulla base del peso molecolare decrescente, Blu destrano (200 kDa), albumina (66 kDa), anidrasi carbonica (29 kDa), citocromo c (12,4 kDa), aprotinin (6,5 kDa), vitamina B12 (1,3 kDa) e seleniometionina (0,2 kDa) ( tutti della Sigma-Aldrich, USA).

L'analisi totale del selenio è stata misurata utilizzando, inizialmente, un Ethos Milestone Pro LabStation (FKV, Italia), microonde di digestione, effettuata per mezzo di serbatoi chiusi di quarzo, dotati di un sistema di controllo di temperatura a infrarossi. Circa 0,3 g dei campioni, in triplo tecnico, sono stati sottoposti ad 1 ora di pre-mineralizzazione con 3 ml di HNO3 per poi aggiungere 1,5 mL di H2O2. Le irradiazioni del forno a microonde sono state effettuate con controllo di

temperatura a regolazione automatica continua della potenza, con l’utilizzo del seguente programma: 37 min a raggiungimento di 180°C e 15 min a 180 C. La misurazione totale del Se è stata effettuata nella Dynamic Reaction Cell (cella di reazione dinamica) utilizzando Rh come standard interno, il metodo ha visto l’aggiunta degli standard interni per la quantificazione, (condizioni operative in Tabella 16). La precisione della quantificazione del selenio è stata valutata attraverso il NIST 8436 ottenendo risultati soddisfacenti, il valore certificato era di 1.1 ± 0.2 μg Se / g di peso secco, con una correttezza del dato del 91% . Il certificato di riferimento del materiale NIST “Semola Farina di frumento 8436” è

Le specie di Se liberate dalle simulazione di digestione gastrointestinale sono state caratterizzate dall’esclusione su HPLC-ICP-MS a scambio anionico. Le specie di selenio negli estratti sono stati identificati dal tempo di ritenzione in corrispondenza con le sostanze standard fuoriuscite assieme agli estratti del campione. I calcoli dei quantitativi sono stati basati sulle aree dei picchi. Misure sono state eseguite modalità seriale con le condizioni operative elencate in Tabella 2. I dati ottenuti sono stati trattati con il software della Perkin-Elmer Chromera.