La messa a punto del kit ha richiesto la scelta della giusta concentrazione di proteina per il coating e di anticorpo primario. Sono state saggiate 6 concentrazioni di proteina 10ng 50ng 100ng 250ng 500ng e 1000ng
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combinate a tre differenti concentrazioni di anticorpo primario (1 ng, 100ng e 250 ng). Per il nostro kit viene effettuato il coating di 250ng per pozzetto di preLMN A/C. Il rivestimento dei pozzetti della piastra viene effettuato, sia per fare successivamente la retta di taratura sia per andare a determinare i campioni incogniti, con la stessa procedura sperimentale:
- Si prepara una soluzione ad una concentrazione di 0.0025µg/µl dell’preLMN A/C in tampone carbonato/bicarbonato pH 9.75.
- In ogni pozzetto vengono aggiunti 100 µl della soluzione precedente (0.25µg di proteina per pozzetto) e si lascia in incubazione a temperatura ambiente, senza agitazione, per 48 h circa.
- Terminate le 48 h di incubazione per il coating, si procede aggiungendo diverse concentrazioni di proteina standard. Si è scelto di procedere con le seguenti concentrazioni: 800ng/100µl; 600ng/100µl; 400ng/100µl; 200ng/100µl; 100ng/100µl; 50ng/100µl; 25ng/100µl e 0ng/100µl (Bianco).
- Al termine dell’incubazione la proteina non legata viene lavata via e si effettua un lavaggio di ogni pozzetto con 350 µl di soluzione PBS/TWEEN 20. Viene effettuato il blocking (procedura che permette di andare a saturare i siti non specifici presenti nel coating): in ogni pozzetto si aggiungono 200 µl di una soluzione di BSA al 3% in T-PBS e si lascia in incubazione a temperatura ambiente e senza agitazione per 2 h.
- Preparazione delle soluzioni standard alle seguenti concentrazioni: Sol. 1 8000 ng/mL
Sol. 2 6000 ng/mL Sol. 3 4000 ng/mL Sol. 4 2000 ng/mL Sol. 5 1000 ng/mL
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Sol. 6 500 ng/mL Sol. 7 250 ng/mL Bianco 0 ng/mL
La preparazione delle soluzioni viene fatta con una procedura di diluizione seriale a partire da una soluzione madre alla concentrazione 16000 ng/mL dello standard in T-PBS e con
l’aggiunta di anticorpo primario con concentrazione di 2500 ng/mL. Il BIANCO contiene una soluzione T-PBS.
- Si getta la soluzione di BSA e si effettua un lavaggio di ogni pozzetto con 350 µl di soluzione T-PBS.
- Si aggiungono in ogni pozzetto 100 µl della soluzione standard di riferimento e anticorpo primario (250ng ). Lascio in incubazione alla temperatura di 37°C e 350 rpm per 2 h.
- Si effettuano 5 Lavaggi da 2 min per ogni pozzetto con 350 µl di soluzione T-PBS.
- Si aggiungono in ogni pozzetto 100 µl di una soluzione di anticorpo 2° con diluizione 1:25000, marcato con enzima, in T-PBS, e si lascia in incubazione a 37°C e 350 rpm per 30 min.
- Si effettuano 5 lavaggi da 2 min di ogni pozzetto, con 350 µl di soluzione T-PBS.
- Si aggiungono in ogni pozzetto 100 µl della soluzione di sviluppo TMB substrate. Si lascia in incubazione al buio a 37°C e 350 rpm per 30 minuti dopodiché si aggiungono 100 µl della stop solution e si effettua la lettura dell’assorbanza alla lunghezza d’onda di 450 nm allo strumento (Wallac).
Sulla base dei dati ottenuti e le concentrazioni note degli standard viene costruita la retta di taratura e ricavata l’equazione che verrà poi utilizzata
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per ottenere la concentrazione di preLMN A/C nei campioni biologici incogniti.
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RISULTATI E DISCUSSIONE
Vimentina
Dai test tramite kit ELISA per Vimentina abbiamo ottenuto i seguenti valori della curva:
ASSORBANZA log abs [VIM],
ng/mL log [VIM], ng/mL PBS 1,51 A 1,655 0,218797998 0 --- B 0,824 -0,08407279 1 0 C 0,512 -0,29073004 2,5 0,39794 D 0,362 -0,44129143 5 0,69897 E 0,301 -0,5214335 10 1 F 0,145 -0,838632 25 1,39794
Sfruttando questi dati di assorbanza e concentrazione, abbiamo ricavato l’equazione lineare y=0,5153x-0.0751 con coefficiente di regressione lineare R2 = 0,9782( Fig.8)
62 log VIM (ng/mL) lo g A 4 5 0 0.0 0.5 1.0 1.5 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0
Fig.8: retta di taratura della Vimentina
Di seguito in figura 9 è riportato il grafico a box ottenuto dall’analisi di tutti i campioni processati suddivisi per classi di studio. Il grafico visualizza il valore medio e il valore massimo e minimo all’interno della classe.
63 EX D T1 T2 T3 0 10 20 30
EX
D
T1
T2
T3
[V
IM
],
n
g
/m
L
Fig.9: Box-plot delle concentrazioni Vimentina
Per valutare che la differenza tra le medie sia significativa e corrispondente ad una effettiva differenza nell’espressione della proteina VIM nei campioni suddetti, si utilizza il test t di Student. La differenza delle medie si considera significativa per valori di p minori di 0,05 (Gli asterischi indicano il grado di significatività: * p=<0,05; **= p<0,01 e ***p=<0,0001). In tabella sono riportati i valori di p ottenuti dai diversi confronti
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t TEST
P
EX vs D
0,050 *
D vs T1
0,039*
D vs T2
0,149
D vs T3
0,0099**
EX vs T3
0,0075**
Anche nel siero, la concentrazione di vimentina risulta maggiore in modo significativo nei pazienti in diagnosi rispetto agli ex-esposti confermando i risultati ottenuti nell’analisi proteomica su biopsie. Dal confronto dei livelli di Vimentina tra pazienti in diagnosi e in terapia, interessante la riduzione ottenuta al tempo più lungo di trattamento, dove le concentrazioni di vimentina ritornano ai valori di controllo.
Già nota è la correlazione tra l'incremento di VIM nello sviluppo e nella progressione dei tumori [53], poiché assieme ad altre proteine, favorisce la transizione epiteliale mesenchimale (EMT). I risultati sui campioni di siero/plasma, ottenuti tramite tecnica ELISA, hanno confermato i dati acquisiti con il WB, dove è stata rilevata una differenza significativa non solo tra i controlli (ex-esposti) e pazienti, ma anche tra i pazienti in diagnosi e terapia.
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Desmina
Dai test tramite Kit Elisa per Desmina abbiamo ottenuto i seguenti valori della curva: [DES],ng/mL Abs-Bianco Bianco 0 0 A 0,312 0,042 B 0,625 0,071 C 2,5 0,297 D 10 0,603 E 20 0,912
Da questi dati si ottiene l’equazione lineare della retta y= 0,04476+0,07137 con R2=0,9543 (Fig.10). D e s m in a ( n g /m L ) A 4 5 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5
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Di seguito in figura 11 è riportato il grafico a box ottenuto dall’analisi di tutti i campioni processati suddivisi per classi di studio. Il grafico
visualizza il valore medio , il valore massimo e il valore minimo della desmina all’interno della classe.
E X D T 0 1 2 3 E X D T [D E S ], n g /m L
Fig.11: Blox-plot delle concentrazioni Desmina
Per valutare che la significatività nella differenza della concentrazione di desmina plasmatica tra i gruppi di pazienti, si utilizza il test t di Student. La differenza delle medie si considera significativa per valori di p minore di 0,05 (Gli asterischi indicano il grado di significatività: * p=<0,05; **= p<0,01 e ***p=<0,0001).
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t TEST
p
EX vs D 0,0046 **
EX vs T 0,0029 **
D vs T 0,4673
Si evidenzia un aumento significativo di 1.5 volte nel confronto tra EX vs D che rimane a valori sovrapponibili alla diagnosi anche dopo terapia. I dati della Desmina ottenuti dai campioni bioptici con la tecnica del WB presentano una diminuzione della proteina nei pazienti affetti da MPM, ciò però non è confermato dagli esperimenti effettuati con tecnica ELISA dove nei campioni di plasma si osserva un minimo aumento dei valori della Desmina nei pazienti (D e T) rispetto ai controlli (EX).