La PCR è una biotecnologia che permette l’amplificazione di sequenze specifiche di DNA. I tratti della sequenza di DNA da amplificare sono delimitati dall’impiego di due oligonucleotidi sintetici: Primer che “ibridizzano”, cioè si legano in maniera complementare al DNA “stampo”.
Il processo di amplificazione si realizza attraverso la denaturazione, appaiamento ed estensione tramite variazioni di temperatura di una miscela contenente il segmento di DNA da amplificare, i primer, nucleotidi che da-ranno origine ai nuovi frammenti di DNA da amplificare e la Taq-poli-merasi.
Alla fine della procedura il frammento di DNA in esame viene am-plificato milioni di volte.
Tale metodologia è attualmente usata, oltre che in studi di genetica di base e applicata, nella diagnostica virologica e nella Medicina Forense in quanto, una dei grandi vantaggi dell’impiego della PCR è quella di poter uti-lizzare microcampioni biologici senza la necessità di estrarre e purificare gli acidi nucleici.
E’ possibile comunque ipotizzare che, con le ricerche applicative attualmente in corso, la completa automazione del procedimento ciclico di amplificazione e di tutte le fasi della procedura, questa metodica possa trovare applicazione anche nel Laboratorio di Immunoematologia, sia per la tipizzazione tessutale (HLA), ma anche eritrocitaria.
Studi sono attualmente in corso per l’identificazione negli amniociti di donne Rh negative, di antigeni Rh fetali per il monitoraggio e la profilassi della malattia emolitica del neonato.
Amplificando con la PCR i frammenti di restrizione ottenuti “digerendo” le catene nucleotidiche che formano gli alleli ABC è stato possibile risalire alla genotipizzazione di questo sistema. L’analisi dei frammenti di restrizio-ne, ottenuti dopo digestione con gli enzimi Kpn I e Alu I, permette l’osserva-zione di segmenti di DNA di diverso peso molecolare, in funl’osserva-zione del geno-tipo ABO del campione in esame, che verranno individuati nel gel come “bande fluorescenti” alla luce U.V. per la presenza nei frammenti stessi del-l’Etidio Bromuro.
Una di queste metodiche prevede una prima fase in cui vengono am-plificate con questa biotecnologia le sequenze nucleotidiche del DNA
appar-tenenti al locus ABO all’interno delle quali sono compresi i nucleotidi 257 e 700 che, come abbiamo visto in precedenza, permettono di differenziare, il primo (258), il gene O dal gene A, il secondo (700) il gene O dal gene B.
In particolare, utilizzando una coppia di primers, che per semplificare indicheremo P1 e P2, viene amplificata una sequenza di 200 paia di basi (pb) che include il nucleotide 258 mentre, con un’altra coppia di primers, indicata con P3 e P4, viene amplificato un segmento di DNA di 128 pb. che comprende il nucleotide n.700.
Una volta ottenuta l’amplificazione dei due frammenti, si procede ad analisi di restrizione degli stessi mediante digestione enzimaticautilizzando, per l’amplificato con P1 e P2 l’enzima di restrizione Kpn I che ha un sito di clivaggio GGTAC/C e per il frammento amplificato con i primers P3 e P4 l’enzima di restrizione Alu I che ha un sito di clivaggio AG/CT.
Dallo schema successivo possiamo notare come la delezione, ovvero l’as-senza nella posizione 258 della Guanina (G), sul frammento di DNA am-plificato dai primers P1 e P2, caratteristica dell’allele O, si determina, a tale livello, la creazione di uno specifico sito di restrizione per l’enzima Kpn I:
253 258 Alleli GTGGTGACCCCT A e B GTGGT- ACCCCT O
---Kpm I
Il “taglio enzimatico” con l’enzima Kpn I è quindi indicativo della presenza dell’allele O per la delezione della Guanina e la formazione del sito di clivaggio per l’enzima di restrizione.
La non “digestione” con questo enzima di restrizione è invece indicativo dell’assenza dell’allele O e quindi della presenza degli alleli A e/o B.
Le varie combinazioni genotipiche possibili possono essere così schematizzate:
- nella omozigosi O/O si ha la formazione di due siti di restrizione per Kpn I e la digestione dei frammenti di 199 pb. in due frammenti di 171 pb e 28 pb (Figura12);
delezione G 258 / Allele O P1 171 pb 28 pb <--- 199 pb ---> 28 pb 171 pb / P2 Allele O 258 delezione G delezione G 258 / Allele O P1 <--- 200 pb ---> 258 P2 Alleli A e/o B G
- nella eterozigosi O/A o O/B si ha la formazione di un singolo sito di clivaggio per Kpn I sull’allele O e nessuna digestione negli alleli A e/o B per cui si avrà la formazione di tre frammenti di DNA: uno di 200 pb derivanti dall’allele O che, come abbiamo visto in precedenza, un sito di clivaggio per Kpn I.
Figura 12.
Figura 13.
- nel caso dell’assenza dell’allele O come nei genotipi A/A, B/B o A/B si avrà la formazione esclusiva di frammenti di 200 pb dovuti alb’assenza del sito di clivaggio per Kpn I.
Nella Figura 15 è rappresentata la disposizione delle “bande fluorescenti” visibili in gel d’agarosio, dopo separazione elettroforetica dei frammenti di DNA amplificati con i primer P1 e P2 e cantenenti il nucleotide 258 che si originano dalla digestione con Kpn I nei diversi genotipi del sistema ABO.
Alleli A e/o B 258 P1 G <--- 200 pb ---> G P2 Alleli A e/o B 258
O/O A/O A/A B/O B/B A/B 200 pb 171 pb 28 pb kpn Figura 14. Figura 15.
Con un procedimento analago ed utilizzando due primers, definiti P3 e P4, viene amplificata una sequenza di cDNA del locis ABO di 128 pb contenente il nicleotide n. 700.
Il trattamento di questi frammenti amplificati con l’enzima di restrizione Alu I permette di differenziare gli alleli A e O dall’allele B in quanto, mentre i primi due alleli contengono nella posizione 700 la guanina (G), l’allele B contiene l’adenina (A) e, la presenza di quest’ultimo nucleotide crea un sito di clivaggio per questo enzima di restrizione come rappresentato nella figura 16.
Le varie combinazioni genotipiche possono essere così schematizzate: - negli omozigoti B/B si avrà la formazione di due siti di clivaggio per Alu I, dovuti alla presenza dell’adenina nella posizione 700 e la formazione di due frammenti di 88 pb e 40 pb (Figura 17).
Alleli 697 700 A, O C C C G G G T T C B C C C A G G T T C Alu I Figura 16.
-negli eterazigoti per l’allele B (A/B, B/O) si avrà la formazione di tre frammenti, ma di 128 pb che si ottiene dagli alleli A e/o O che non hanno l’A in posizione 700 e quindi non permettono la formazione di un sito per Abi I e due frammenti rispettivamente di 88 pb e 40 pb derivanti dalla digestione di Alu I dell’allele B che ha, come detto in precedenza, l’A in posizione 700 (Figura 18).
La mancata digestione enzimatica dei frammenti di 128 pb da parte di Alu I infine indicherà l’assenza dell’allele B e quindi della presenza dei genotipi A/A, A/0 e 0/0 (Figura 19).
Nella Figura 20 è rappresentata la disposizione delle bande “fluorescenti” visibili su gel d’agarosio dopo separazione elettroforetica e derivanti dalla digestione dei frammenti di cDNA con l’enzima di restrizione Alu I nei diversi genotipi del sistema ABO.
700 / Allele B P3 88 pb A 40 pb <--- 128 pb ---> 40 pb / A 88 pb P4 Allele B 700 Figura 17.
Comparando quindi i risultati delle digestioni enzimatiche con Kpn I e Alu I si può quindi risalire all’attribuzione del genotipo ABO nel campione in esame. 700 Alleli A e/o O P3 G <--- 128 pb ---> <----40 pb <----88 pb ---> 700 P4 Allele B A Figura 18. 700 allele A e/o O P3 G <--- 128 pb ---> G P4 700 Allele A e/o O Figura 19.
O/O A/O A/A B/O B/B A/B 128 pb
88 pb 40 pb
Figura 20.
Kpn I Alu I
Digestione completa O/O B/B Digestione parziale A/O, B/O A/B, B/O Assenza di digestione A/A, A/B, B/B A/A, A/O, O/O
Tabella 10. Interpretazione del genotipo ABO dai prodotti di amplificazio -ne del cDNA con gli enzimi di restrizio-ne Kpm I e Alu I.
Conclusioni
Allo stato attuale delle conoscenze, le ricerche biochimiche e di biologia molecolare effettuate sul sistema isto-ematico ABO hanno permesso di chiarire che:
I geni A e B codificano delle glicosiltransferasi che catalizzano su v a r i e molecole lipidiche e proteiche l’inserimento di oligosaccaridi immunodomi-nanti responsabili delle specificità A e B mentre il gene O dà origine ad una molecola sprovvista di tale attività enzimatica.
Le regioni codificanti degli alleli A e B mostrano tra loro un elevato grado di omologia (99%) e le differenze fra i due alleli si limitano a sette nucleotidi. Quattro di queste provocano cambiamenti nelle sequenze delle proteine co-dificate (transferasi), ed in particolare provocano il cambiamento di quattro aminoacidi.
Le altre tre sequenze nucleotidiche diverse sono silenti, non provocano cioè nessun cambiamento della sequenza aminoacidica delle transferasi.
Queste sostituzioni aminoacidiche sono alla base della diversa specificità delle transferasi nelle reazioni zucchero-nucleotide che portano alla biosin-tesi degli antigeni A e B che, come abbiamo visto nella parte dedicata alla biochimica di questo sistema, risultano essere: UDP-Nacgluc per l’antigene A e UDP-Gal per l’antigene B.
In particolare delle 4 sostituzioni aminoacidiche, mentre la prima (argini-na in A, glici(argini-na in B), non riveste importanza nella determi(argini-nazione di questa specificità, la terza e la quarta sostituzione (leucina e glicina in A, metionina e alanina in B) e, in minor misura la seconda sostituzione, (glicina in A e se-rina in B) modificano la flessibilità delle due proteine e questo sembra essere la causa delle due diverse specificità zucchero-nucleotide.
Nei soggetti con fenotipo O si ha la delezione di un singolo nucleotide che dà luogo ad uno spostamento della cornice di lettura che provoca la traduzione, da parte dell’RNAm, di una proteina enzimaticamente inattiva.
Differenze a livello delle sequenze nucleotidiche sono state individuate anche fra gli alleli Al e A2. In particolare sono state identificate una so-stituzione ed una delezione di singole basi nella sequenza codificante del-l’ultimo esone dell’allele A2.
La delezione della singola base è localizzata nella porzione che codifica la parte carbossi-terminale della transferasi, nella zona cioè dove risiede il sito attivo della proteina e questa sembra essere la causa della debole attività e della diversa cinetica di questa transferasi che provoca una differenza qualitativa e quantitativa nei carboidrati che costituiscono l’antigene A2.
La causa della debole attività transferasica dei fenotipi A3, B3 e degli altri fenotipi più “deboli” sembra dovuta alla sostituzione di una singola base. Questo provoca un cambiamento di un aminoacido con conseguente mo-difica dell’alfa-elica della proteina como-dificata e decremento della sua attività transferasica.
Nel caso dei fenotipi deboli e particolarmente i fenotipi B sembra comunque che la genetica molecolare sia eterogenea e si diversifichi tra i vari fenotipi.
- Cis-AB: anche per questo raro fenotipo che fu inizialmente ipotizzato es-sere il frutto di un crossing-over intragenico fra gli alleli A e B sono state ef-fettuate ricerche di genetica molecolare. Da queste sembra che una mu-tazione puntiforme che avviene nel DNA di questi soggetti dia origine ad una transferasi con attività bifunzionale.
Da quanto in precedenza descritto si può comprendere come queste bio-tecnologie siano di estrema utilità non solo per una maggior comprensione della genetica molecolare del sistema ABO, ma possano servire anche per lo studio di altri sistemi gruppo-ematici.
Dato inoltre che questi geni sono stati conservati nel corso della evolu-zione, probabilmente ci permetteranno di meglio comprendere le loro fun-zioni biologiche che, allo stato attuale delle conoscenze, non sono ancora suf-ficientemente chiarite.
E’ prevedibile inoltre che i fenotipi eritrocitari e particolarmente i “rari” o alcuni ancora non individuati potranno essere accuratamente documentati anche nel DNA senza le ricerche sierologiche le quali, almeno a breve termine, non potranno ovviamente essere sostituite.
Non solo, ma se si considera che l’espressione di questi antigeni isto-ematici va incontro a notevoli cambiamenti durante la differenziazione e l’oncogenesi si comprende anche l’interesse pratico che tali ricerche possono avere in futuro.
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Indice
Editoriale . . . » 3
Introduzione . . . » 5
Sierologia del sistema ABO . . . » 6
Sottogruppi Al e A2 . . . » 10
Fenotipi A e B deboli . . . » 10
Il fenotipo cis-AB” . . . » 12
Gli anticorpi del sistema ABO . . . » 15
Anticorpi naturali . . . » 16
Anticorpi “immuni” . . . » 17
Autoanticorpi . . . » 17
Anticorpi monoclonali . . . » 17
Metodiche sierologiche per la tipizzazione degli antigeni ABO . . . » 18
Errori Tecnici . . . » 20
Caratteristiche fenotipiche particolari delle emazie . . . » 20
Caratteristiche particolari dei siero . . . » 21
Poliagglutinabilità degli eritrociti . . . » 22
Biochimica del sistema ABO . . . » 23
Biologia molecolare del sistema ABO . . . » 35
La sintesi proteica . . . » 35
Cornice di lettura . . . » 36
Reazione di polimerizzazione a catena (PCR) . . . » 41
Conclusioni . . . » 47
Bibliografia . . . » 49
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biochimici del rimodellamento osseo. Aprile ‘94.
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