7.3.1 PARTE SPERIMENTALE
Al termine delle analisi ESEM, i campioni di biopsie cutanee prelevati dal paziente A sono stati tagliati in sezioni trasversali di circa 2 mg di peso. I campioni sono stati tagliati a mano, utilizzando un bisturi usa e getta. Le singole sezioni ottenute sono state trasferite in microprovette e mineralizzate con 100 μL di TMAH. La disgregazioneè stata condotta per tutta la notte in bagno termostato a 60°C. Immediatamente prima delle analisi ICP-MS, i digeriti sono stati diluiti 200 volte in una soluzione Triton X-100 0.1% v/p e NH4OH 2.8% m/m e la
concentrazione totale di Ag è stata quantificata utilizzando la calibrazione esterna, secondo le modalità riportate nella sezione 6.4.
Le biopsie cutanee prelevate dai pazienti B, C e D sono state tagliate con il criomicrotomo per ottenere sezioni sottili da destinare alle analisi LA-ICP-MS (per ulteriori dettagli si veda la sezione 7.4). Una volta ottenuto un numero sufficiente di sezioni sottili, il rimanente campione è stato tagliato in sezioni trasversali e mineralizzato come descritto nel precedente paragrafo. Nel caso del campione prelevato dal paziente D, è stato necessario diluire i digeriti 400 volte per ottenere un valore di concentrazione di Ag che ricadesse all’interno della curva di calibrazione.
94 7.3.2 RISULTATI E DISCUSSIONE
In figura 19 sono presentati i profili di concentrazione dell’Ag nelle biopsie prelevate dal paziente A dopo 7 giorni di trattamento. I campioni sono stati presi dall’area guarita e dall’area cruenta. La figura 19 mostra come nel campione prelevato dalla zona guarita la concentrazione di Ag diminuisca molto rapidamente passando da 50.8 ± 0.8 ng·mg−1 misurati nella sezione più superficiale, a 6.0 ± 0.2 ng·mg−1 quantificati nella seconda sezione. Questo andamento continua anche nelle sezioni successive e in questa parte del campione la concentrazione di Ag varia tra 0.04 e 0.1 ng·mg−1. Nel campione prelevato dall’area non guarita, sebbene la concentrazione di Ag nella sezione più superficiale sia leggermente più bassa (37.5 ± 0.6 ng·mg−1), la diminuzione della concentrazione di Ag lungo il profilo è più graduale e meno marcata rispetto a quella osservata nel campione preso dall’area guarita: nella seconda e nella terza sezione del campione, infatti, la concentrazione di Ag è pari rispettivamente a 29.8 ± 0.5 e 9.6 ± 0.2 ng·mg−1. La quantità totale di Ag nel campione prelevato dall’area cruenta è pari a 223 ng, un valore leggermente superiore a quello misurato nel campione prelevato dalla zona guarita (171 ng). Il campione che è stato prelevato dopo una seconda applicazione di Acticoat™ Flex3 e ulteriori 10 giorni di trattamento, presenta un profilo di concentrazione simile a quello osservato nel campione guarito e che era stato trattato per 7 giorni. È interessante notare che, sebbene l’andamento del profilo di concentrazione sia simile, la concentrazione di Ag misurata nel campione trattato con due applicazioni è praticamente doppia rispetto a quella misurata nel campione trattato con una singola applicazione di Acticoat™ Flex3: la concentrazione misurata nelle prime tre sezioni del campione sottoposto a due applicazioni di AgNPs sono rispettivamente 110 ± 2, 31.0 ± 0.7 e 13.2 ± 0.1 ng·mg−1. In figura 19 è presentato, inoltre, il confronto tra i profili di concentrazione di Ag nei campioni di biopsia cutanea e le colorazioni istologiche con blu di toluidina effettuate sui replicati degli stessi. L’affiancamento delle immagini consente di correlare la capacità di penetrazione dell’Ag nei tessuti con l’organizzazione strutturale di questi. Il campione di pelle prelevato dall’area guarita presenta la tipica struttura ben organizzata del tessuto sano. Grazie alla struttura ben organizzata e compatta della cute guarita, gli agglomerati di AgNPs rilasciati dall’Acticoat™ Flex3 non sono in grado di raggiungere gli strati più profondi del derma, ma rimangono immobilizzati prevalentemente negli strati mediani e superficiali del tessuto dermico. Con il procedere della guarigione della lesione e della sua riepitelizzazione, i fibroblasti contenenti gli agglomerati di AgNPs vengono coperti dai cheratinociti che hanno formato la nuova epidermide. Al contrario il campione di cute prelevato dall’area non guarita è caratterizzato da un’archittetura caotica e disordinata: la normale organizzazione del tessuto connetivo non è
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stata ancora ristabilita, i fibroblasti sono poco numerosi e molto distanziati tra loro. La mancanza di un tessuto compatto e ben formato consente alle AgNPs rilasciate dalla medicazione di raggiungere gli strati più profondi del derma.
Figura 19: Profili di concentrazione dell’Ag (ng·mg−1) dopo 7 giorni di trattamento. In questo studio pilota, le biopsie destinate alle analisi dell’Ag sono state prese da un unico paziente. Una biopsia è stata prelevata da un’area guarita dell’ustione (parte alta dell’immagine), mentre l’altra biopsia è stata presa da un’area non guarita (parte bassa dell’immagine). Immagini delle colorazioni istologiche effettuate sul replicato del campione sono state ottenute attraverso analisi di microscopia ottica. Per confrontare i due campioni sono presentati ingrandimenti di aree particolarmente interessanti e rappresentative della struttura dei tessuti.
Come precedentemente osservato attraverso gli esperimenti condotti sulle colture cellulari tridimensionali e la quantificazione dell’Ag nelle frazioni MTT e iDMSO (si veda la sezione 6.4), anche nei campioni di pelle la concentrazione di Ag aumenta linearmente con il numero di medicazioni applicate. Il campione di pelle prelevato dal paziente A dopo due applicazioni di
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Acticoat™ Flex3, infatti, presenta una concentrazione di Ag totale doppia (424 ng di Ag) rispetto a quella misurata nel campione di pelle prelevato dalla zona non guarita dopo un singolo trattamento con la medicazione (223 ng di Ag). Il fatto che la concentrazione totale di Ag nel campione non guarito sia leggermente più alta rispetto a quella misurata nel campione guarito a parità di tempo di trattamento e numero di applicazioni dell’Acticoat™ Flex 3, si può spiegare tenendo in considerazione che la presenza di essudati e fludi corporei può aumentare il rilascio di Ag da parte della medicazione [86, 247].