Risposta ai diversi materiali dell’elettrodo rivestito

L’obiettivo di questo primo set di prove sperimentali è stato il confronto tra il rivestimento in vetro e quello in polyimide mediante ispezione al microscopio.

I parametri per confrontare i due tipi di coating sono stati: 9 Conta cellulare dei neuroni

9 Adesione del neurone all’elettrodo

9 Morfologia superficiale tramite visione al microscopio ottico

I test sono stati eseguiti su pezzetti di elettrodo rivestiti. Su tali frammenti sono state coltivate cellule non differenziate, trattate in modo da inibire il processo di duplicazione cellulare. L’inibizione della mitosi si è resa necessaria per rendere confrontabili le misure di densità cellulare realizzate in momenti diversi.

La scelta di operare con cellule non differenziate deriva dall’osservazione dell’osservazione sperimentale di un’adesione migliore al substrato. Questo consente di migliorare enormemente l’affidabilità dei risultati registrati e diminuisce drasticamente il margine di errore.

L’inibizione della mitosi può essere facilmente ottenuta per aggiunta di NGF: se l’NGF viene aggiunto a cellule immerse nel terreno di coltura completo (anziché nel mezzo tal quale o in terreno all’1% di siero), si ottiene l’effetto che i due processi antagonisti di duplicazione da un lato e di differenziazione cellulare dall’altro si inibiscono in modo reciproco.

I passi seguiti per realizzare questa prima prova sono stati i successivi:

1) Pulizia con etanolo di due elettrodi non forati, uno con coating in biossido di silicio e uno in polyimide; successiva sterilizzazione tramite plasma etching e ponendoli sottocappa con lampada a raggi UV accesa per circa 30 minuti.

2) Da ciascuno dei due fili sono stati ricavati tre pezzetti di lunghezza 1 cm.

3) Questi sono stati immersi in una Petri da 35 mm di diametro ed è stato applicato uno strato di collagene (in soluzione 1:10).

4) All’asciugatura del collagene si aggiunge il terreno di coltura completo contenente le cellule allo stato embrionale. Le cellule sono state messe in coltura; dopo circa 48 ore è stato aggiunto il NGF in concentrazione di 300 µl/ml.

5) Atteso il tempo necessario per la completa adesione del corpo cellulare, nei giorni successivi, quotidianamente, il campione è stato trattato come descritto in tabella 7.1.

Trattamento Descrizione

Giorno 1 Conta cellulare Conta della densità cellulare

tramite microscopio ottico invertito.

Giorno 2 Conta cellulare Come sopra

Giorno 3 Prova di adesione Il terreno di coltura viene

aspirato, la Petrì risciacquata con una soluzione di PBS all’1%. Il nuovo terreno di coltura è aggiunto nella Petrì e la conta cellulare viene effettuata tramite ispezione al microscopio invertito.

Tabella 7.1

Per svolgere le prove di test in modo semplice e ottenere delle immagini significative ai nostri scopi, è stato deciso di prendere come riferimento le due estremità del frammento dell’elettrodo e una parte centrale del medesimo; in questo modo è stata garantita la ripetibilità del test ed è stato definito il punto di riferimento per registrare le immagini.

Le immagini 7.1 mostrano le parti terminali e la parte centrale di uno dei frammenti di elettrodo rivestito in biossido di silicio.

Elettrodo rivestito in vetro immerso nella coltura cellulare, al giorno 2.

Elettrodo rivestito in vetro immerso nella coltura cellulare, al giorno 3.

Figura 1.a : apice sinistro del frammento di elettrodo Figura 1.b: apice sinistro del frammento di elettrodo

Figura 2.a: parte centrale del frammento di elettrodo Figura 2.b: parte centrale del frammento d'elettrodo

Figura 3.a: apice destro del frammento d'elettrodo Figura 3.b: apice destro del frammento d'elettrodo

Figura 7.1: immagine dell'elettrodo rivestito in biossido di silicio, al giorno 2 e al giorno 3 ottenute con microscopio ottico

Lo stesso set di immagini è stato registrato per l’elettrodo con rivestimento in polyimide, come mostrato in fig. 7.2.

Elettrodo rivestito in polyimide immerso nella coltura cellulare, al giorno 2.

Elettrodo rivestito in polyimide immerso nella coltura cellulare, al giorno 3.

Figura 1.a: apice sinistro del frammento di elettrodo Figura 1.b: apice sinistro del frammento di elettrodo

Figura 2.a: parte centrale dell'elettrodo Figura 2.b: parte centrale dell'elettrodo

Figura 3.a: apice destro dell'elettrodo Figura 3.b: apice destro dell'elettrodo

Figura 7.2: immagine dell'elettrodo rivestito in polyimide, al giorno 2 e al giorno 3 ottenute con microscopio ottico

Dal confronto tra le due colonne di immagini della fig. 7.1, per l’elettrodo in vetro si possono fare alcune osservazioni:

1. le cellule sono aderite e si sono moltiplicate preferibilmente nella zona circostante l’elettrodo rispetto al resto del substrato di coltura;

2. risciacquando con la soluzione, il numero di cellule rimaste attaccate è alto e in particolare non vengono rimosse proprio quelle più vicine all’elettrodo;

3. il vetrino nel suo complesso, e il filo di tungsteno in particolare, sembrano non contaminare la popolazione cellulare; l’elettrodo non sembra essere danneggiato da questo utilizzo né viene spostato durante il risciacquo con PBS.

Analogamente, dalle immagini 7.2 dell’elettrodo rivestito in PI si possono osservare alcune caratteristiche dell’elettrodo:

1. le cellule si sono riprodotte inizialmente in modo definito intorno al filo, preferendo la zona ad esso circostante;

2. dopo il risciacquo con la soluzione di PBS, la popolazione cellulare è stata rimossa quasi al completo e le poche cellule non staccate non si trovano sull’elettrodo;

3. il vetrino risulta nel suo complesso più “sporco”, e si nota che all’apice del filo il rivestimento sembra essersi ammorbidito nel collagene in cui è immerso, dando origine ad una zona “nebulosa” intorno all’elettrodo stesso.

Complessivamente, per i tre aspetti che abbiamo elencato ad inizio paragrafo, si può affermare che: • Per quanto riguarda la conta cellulare, è evidente che entrambi gli elettrodi costituiscono un

buon substrato per la coltura, anche se solo nel caso di rivestimento con biossido di silicio la crescita è preferenziale intorno e sull’elettrodo stesso.

• L’adesione delle cellule è decisamente migliore sull’elettrodo con coating di biossido di silicio, poiché con il rivestimento polimerico, la popolazione cellulare si è completamente staccata.

0 20 40 60 80 00 apice SN parte centrale apice DX prima del risciacquo dopo il risciacquo 0 20 40 60 80 100

apice SN parte apice DX

prima del risciacquo dopo il risciacquo

Figura 7.3: grafico della densità di cellule adese (in n° di cell/ mmq) nella zona circostante l’elettrodo rivestito in vetro, prima e dopo il risciacquo del campione con la soluzione di PBS.

Figura 7.4: grafico della densità di cellule adese (in n° di cell/ mmq) nella zona circostante l’elettrodo rivestito in PI, prima e dopo il risciacquo del campione con la soluzione di PBS.

• L’analisi morfologica mette in luce come l’inserzione dell’elettrodo rivestito in vetro non alteri l’aspetto e la conformazione della coltura cellulare in prossimità dell’elettrodo stesso, rispetto al resto della Petrì. Al contrario nel caso dell’elettrodo rivestito in PI, lo strato di collagene in prossimità dell’elettrodo assume un aspetto estremamente irregolare e disomogeneo, se confrontato alla distribuzione uniforme che caratterizza il resto della Petrì. Questo è probabilmente legato alla natura del materiale polimerico e alla disomogeneità del suo spessore (che è una caratteristica intrinseca della tecnica di deposizione del polimero). Al contrario l’uniformità del deposito del vetro (caratteristica di un processo di PVD) conferisce al film di

collagene un aspetto regolare e uniforme, ben visibile nelle fig. 7.1. Inoltre durante le prove, i campioni contenenti elettrodi in vetro sono risultati più limpidi, mentre gli altri hanno dimostrato un certo deterioramento del terreno di coltura.