Le caratteristiche delle dispersioni polimeriche PVP e PAA sono riportate in tabella 1. Le dispersioni sono state ottenute a pH neutro ed ad un valore di osmolalità compatibile con la somministrazione oculare. La dispersione PAA presenta un valore di osmolalità più elevato, 383 mOsmol/Kg, a causa della presenza di alte quantità di mannitolo e lattosio, prodotti necessari per poter ottenere, dopo liofilizzazione, una matrice di consistenza adeguata alla manipolazione.
In tabella 3 sono riportati i valori di viscosità delle dispersioni polimeriche analizzate dopo la preparazione e dopo la ricostituzione da matrici liofilizzate e matrici liofilizzate e sterilizzate (dati da un altro lavoro). Come può essere osservato la dispersione a base di PVP, che presenta un comportamento reologico di tipo newtoniano, mantiene un valore di viscosità pressoché costante dopo la reidratazione delle matrici liofilizzate, anche dopo il processo di sterilizzazione. Per quanto riguarda PAA, invece, il comportamento è molto diverso: si osserva una drastica diminuzione dei valori di viscosità relativa della dispersione iniziale (13209,91 mPa s), sia dopo il processo di liofilizzazione (7058,30 mPa s) che dopo quello di sterilizzazione (1,97 mPa s). Questo risultato è probabilmente dovuto a fenomeni di depolimerizzazione del prodotto a causa dei trattamenti subiti, soprattutto per il trattamento con raggi gamma i quali possono provocare la rottura delle catene polimeriche principali e secondarie e la loro successiva ricombinazione casuale, o la generazione di legami trasversali, che portano a molecole con peso medio inferiore a quello di partenza. Questo fenomeno si ripercuote sicuramente meno sulla reologia di fluidi con comportamento newtoniano rispetto a fluidi con comportamento di tipo pseudoplastico.
I tempi di ricostituzione delle dispersioni polimeriche dalle matrici, riportati in tabella 4, sono risultati compatibili con una somministrazione in vivo: circa 2 minuti per le matrici a base di PVP e 4 minuti per quelle a base di PAA. Dai dati ottenuti si può osservare una tendenza all’allungamento dei tempi di reidratazione delle matrici medicate, anche se questo incremento è poco significativo, nell’ordine di 10-20 s. Il processo di sterilizzazione sembra influenzare la struttura delle matrici, in quanto si nota una diminuzione dei tempi di reidratazione dopo la
sterilizzazione, tempi che risultano quasi dimezzati: da 243,34±7,57 a 175,00±8,89 s per M-PAA e da 102,34±7,37 a 51,00±5,57 s per M-PVP. Contrariamente ai dati reologici, i tempi di reidratazione indicano che qualcosa cambia anche nella struttura di M-PVP dopo il processo di sterilizzazione. È presumibile che le modifiche conseguenti all’irraggiamento non riguardino tanto la struttura del polimero quanto quella della matrice stessa; si potrebbe avere una dilatazione della struttura con conseguente aumento delle dimensioni dei pori e quindi un’area superficiale specifica più elevata disponibile per il contatto con il solvente.
I due polimeri impiegati hanno mostrato avere diametri idrodinamici delle molecole estremamente diversi, 51,24±17,65 e 2056,95±821,53 nm rispettivamente per PVP e PAA (tabella 5). Queste differenze potrebbero spiegare le diverse caratteristiche reologiche delle dispersioni polimeriche ed i diversi tempi di reidratazione delle matrici. Molecole con diametro idrodinamico elevato formano grovigli molto più complessi rispetto a molecole più piccole, risultando in valori di viscosità più elevati e tempi di ricostituzione più lunghi. I dati ottenuti dimostrano che non vi sono cambiamenti nel diametro idrodinamico medio dei polimeri dopo il processo di liofilizzazione e quello di sterilizzazione. Questo è piuttosto verosimile considerando che i polimeri presentano dimensioni molecolari (PM) estremamente disperse e che il dato ottenuto per DLS è un dato medio rappresentativo delle popolazioni molecolari più significative del polimero.
La calorimetria a scansione differenziale era stata impiegata nel tentativo di caratterizzare ulteriormente le matrici polimeriche ed il lisato piastrinico.
Dai termogrammi delle due dispersioni polimeriche (figg. 7 a-d), PVP e PAA, è possibile evidenziare il picco di fusione dovuto all’acqua (intorno a 0 °C) ed un ulteriore picco che potrebbe corrispondere alla fusione del polimero. E’ comunque evidente la similitudine di temperatura e forma di tale picco fra le due diverse sostanze, tale da far ritenere che questo non sia significativo. Tale profilo è replicato per il lisato piastrinico e per tutte le combinazioni di prodotti (polimero e LP) analizzate (figg. 7 e-h).
Dai termogrammi ottenuti è stato possibile ricavare alcune informazioni, ma questi non sono risultati utili per caratterizzare il LP e le matrici polimeriche, medicate e non.
della velocità di guarigione di una ferita superficiale corneale. Il presupposto del saggio è che le sostanze che accelerano la riduzione dell’apertura fra le due aree cellulari siano sostanze in grado di accelerare la guarigione di lesioni dell’epitelio corneale.
I risultati dei saggi biologici sono riportati in tabella 6 ed in forma grafica in fig. 8, come riduzione dello spazio di apertura fra le due aree cellulari nel tempo, rappresentante lo spazio e la velocità di migrazione cellulare.
Dai risultati è evidente che la sottrazione del siero fetale bovino dal mezzo di crescita cellulare porta ad un rallentamento, seppure minimo, nella proliferazione e migrazione cellulare. Tale effetto viene compensato se il mezzo di crescita SS viene implementato con una uguale quantità di arabinogalattano. Questa sostanza è infatti conosciuta per la sua attività di stimolo della proliferazione e migrazione cellulare (Burgalassi et al., 2011).
Quando il mezzo di crescita SS viene implementato con una uguale quantità di LP tale effetto non è visibile, anzi si assiste ad una diminuzione della velocità di migrazione delle cellule sul fronte dell’apertura, (da 28,58±2,17 a 15,58±0,70 /h per mezzo SS e LP, rispettivamente). L’effetto del LP è invece evidente quando questo è veicolato nella formulazione polimerica; l’aggiunta di M-PVP/LP e M-PAA/LP al mezzo di crescita SS porta in ogni caso ad un incremento nella velocità di chiusura dello spazio fra le aree cellulari e quindi del tempo stimato di copertura completa dello spazio. Questo effetto, maggiormente evidente per M- PVP/LP, la cui velocità di migrazione cellulare è paragonabile a quella ottenuta con il mezzo di crescita arricchito con il siero fetale bovino, sembrerebbe coadiuvato dalla presenza del polimero. È infatti noto che alcuni polimeri abbiano la proprietà di facilitare l’adesione delle cellule al substrato e quindi di facilitarne il processo di migrazione. PVP sembra presentare questa proprietà, non nota in letteratura e quindi sicuramente da approfondire con ulteriori studi; il tempo stimato di chiusura dello spazio fra le aree cellulari risulta paragonabile a quello ottenibile con il mezzo di crescita cellulare completo (9,54 e 9,94 ore, rispettivamente per mezzo di crescita e M-PVP).
In conclusione, LP sembra presentare un’attività sulla velocità di proliferazione delle cellule che però necessitano di un ulteriore stimolo per l’adesione e quindi per il processo di migrazione, stimolo impartito dal polimero impiegato nella formulazione, in modo particolare da PVP.
Studi futuri punteranno, oltre ad approfondire l’attività di PVP sulle cellule epiteliali corneali, a mettere in evidenza l’attività proliferativa di LP con un saggio dedicato.
Tabelle
e
Formulazione Polimero(% p/p) Mannitolo(% p/p) Lattosio(% p/p) Solvente pH Osmolalità(mOsml/Kg)
PVP 3,0 2 / Tampone 6,96 280
PAA 0,2 5 2 H2O 6,79 383
Tabella 1: composizione e caratteristiche delle dispersioni polimeriche
Tabella 2: concentrazioni delle dispersioni polimeriche sottoposte ad analisi DLS
Formulazioni
polimeriche Diluizioni Materiale di partenza
1:10 1:50 1:100 PVP 1:150 1:50 PAA 1:100
Dispersioni polimeriche preparate non meno di 48 ore prima del loro utilizzo.
PVP 1:100
PAA 1:100
Dispersioni polimeriche ricostituite da matrici liofilizzate, per aggiunta dell'opportuna quantità di acqua.
PVP 1:100
PAA 1:100
Dispersioni polimeriche ricostituite da matrici liofilizzate e sterilizzate, per aggiunta dell'opportuna quantità di acqua.
Tabella 3: valori di viscosità delle dispersioni polimeriche
Tabella 4: tempi di reidratazione delle matrici allo studio (n = 3)
Diametro idrodinamico (nm) ± DS Formulazione
Dispersione iniziale Dispersione daliofilizzato liofilizzato sterilizzatoDispersione da
PVP 51,24 ± 17,65 39,77 ± 19,56 33,10 ± 20,36
PAA 2056,95 ± 821,53 1486,00 ± 355,34 1922,97 ± 59,91 Tabella 5: diametri idrodinamici dei polimeri allo studio ottenuti mediante analisi DLS (n = 3) Viscosità (mPa•s) Formulazione PRE Liofilizzazione Dispersione ricostituita POST Liofilizzazione Dispersione ricostituita POST Sterilizzazione Comportamento Reologico PVP 4,36 4,98 5,17 Newtoniano PAA 13209,91 7058,30 1,97 Pseudoplastico Tempi di reidratazione (s) ± DS Formulazione Dispersione ricostituita POST Liofilizzazione Dispersione ricostituita POST Sterilizzazione M-PVP 102,34 ± 7,37 51,00 ± 5,57 M-PAA 243,34 ± 7,57 175,00 ± 8,89 M-PVP/LP 137,67 ± 8,50 - M-PAA/LP 272,00 ± 9,64 -
Formulazioni Migrazione dopo6 ore (m)±e.s. Velocità di migrazione (m/h)±e.s. Tempo di chiusura (h) Mezzo di crescita 200,00 ± 2,50 33,79 ± 0,62 9,54 Mezzo SS 177,67 ± 32,05 28,58 ± 2,17 11,28 LP 100,83 ± 10,22 15,58 ± 0,70 20,70 M-PVP 194,17 ± 1,67 32,44 ± 0,93 9,94 M-PAA 66,67 ± 5,83 10,27 ± 0,50 31,40 M-PVP/LP 187,50 ± 12,00 32,05 ± 1,00 10,06 M-PAA/LP 190,00 ± 14,17 29,66 ± 1,58 10,87 Arabinogalattano 213,75 ± 7,08 33,57 ± 1,30 9,61
Tabella 6: risultati del test di proliferazione e migrazione cellulare
Fig. 4: rappresentazione grafica dell'analisi DLS della dispersione di PAA 0.2% diluizione 1:100
(a) (b)
Fig. 6: microfotografie di HCE messe in contatto con (a) PVP/LP e con (b) LP ai tempi di 0, 2, 4 e 6 ore
Tempo 0
2 h
4 h
Fig. 7a
Fig. 7b
Fig. 7d
Fig. 7e
Fig. 7g
Fig. 7h
Fig. 7: termogrammi della (a) dispersione polimerica di PVP, (b) dispersione polimerica di PAA, (c) dispersione ricostituita da M-PVP, (d) dispersione ricostituita da M-PAA, (e) lisato piastrinico, (f) lisato piastrinico liofilizzato e reidratato, (g) dispersione ricostituita da M- PVP/LP, (h) dispersione ricostituita da M-PAA/LP
Bibliografia
- Alio J.L., Abad M., Artola A., Rodriguez-Prata J.L., Pastor S., Ruiz-Colecha J., Use of autologous platelet-rich plasma in the treatment of dormant corneal ulcers, Ophthalmology, 114:1286-1293,2007.
- Burgalassi S., Nicosia N., Monti D., Falcone G., Boldrini E., Fabiani E., Lenzi C., Pirone A., Chetoni P., Arabinogalactan as active compound in the management of corneal wounds: in vitro toxicity and in vivo investigations on rabbits, Curr Eye Res., 36:21-28,2011.
- DelMonte D. W., Kim T., Anatomy and physiology of the cornea, J Cataract Refract Surg., 37:588-598,2011.
- Holland S., Morck D., Schultz C., Treatment of corneal defects with delayed re- epithelization with a medical device/drug delivery system for EGF, Clin Experiment Ophthalmol, 40:662-8,2012.
- Hosmani, A.H., Throat, Y.S., Kasture, P.V., Carbopol and its pharmaceutical significance: a review, Pharmainfo.net,2006.
- Mafee M.F., Karimi A., Shah J., Rapoport M., Ansari A.S., Anatomy and pathology of the eye: role of MR imaging and CT, Radiol Clin N Am, 44:135-157,2006.
- Màrquez E.B., De Ortueta D., Royo S.B., Martìnez-Carpio P.A., Epidermal growth factor receptor in corneal damage: update and new insights from recent reports, Cutan Ocul Toxicol, 30:7-14,2010.
- Maurice, D.M., Mishima, S., Ocular pharmacolkinetics., Sears, M.L. (ED.), Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 69, Springer, Berlin, 16-119,1984.
membrane transplantation in the human eye, Dtsch Arztebl Int, 108:243-8,2011. - Miglior M., Oftalmologia Clinica, Monduzzi editore, 1: 7-15; 5: 66-71,10: 219-252,
1999.
- Rusciano D., Meloni M., Bucolo C., Stagni E., La Bruna M., Effetto degli aminoacidi sulla riepitelizzazione in modelli in vitro e in vivo, Superficie oculare, 1:7-8,2009.
- Sandri G., Bonferoni M.C., Rossi S., Ferrari F., Mori M., Del Fante C., Perotti C., Caramella C., Thermosensitive eyedrops containing platelet lysate for the treatment of corneal ulcers, Int J Pharm, 426:1-6,2012.
- Vecchio S., Santilli E., D’Ettoris A.R., Musuraca V., Leonardo P., Maltese P., Geremicca W., Schipani G., The use of platelet-rich plasma for the topical treatment of corneal lesions, Blood Transfus, 4: 133-40,2006.
- Vinciguerra P., Camesasca F.I., Ponzin D., Use of amino acids in refractive surgery, J Refract Surg., 18(Supp):S374-7,2002.
- Yu F., Yin J., Xu K., Huang J., Growth factors and corneal epithelial wound healing, Brain Res Bull, 81:229-235,2010.