Lo studio riportato da questo lavoro di tesi rientra nel progetto italiano mt- HPP che fa parte dello studio ad ampio raggio della Human Proteomic Organization(HUPO): il chromosome-centric Human Proteome Project (c- HPP). Il c-HPP ha come scopo quello di caratterizzare le proteine codificate dai 24 cromosomi nucleari entro il 2022. I cromosomi sono stati assegnati a differenti nazioni (figura 16) ed all’Italia è stato attribuito il mitocondrio.
Figura 16: Schema del chromosome-centric Human Proteome Project (c-HPP).
L’iniziativa del mt-HPP è guidata dall’Italian Proteomics Association (ItPA), società di cui fa parte il nostro laboratorio, ed ha l’obiettivo di integrare il c-
HPP con la caratterizzazione delle proteine codificate dal DNA mitocondriale (mtDNA). Infatti molte delle proteine codificate a livello nucleare giocano un ruolo importante nella patofisiologia mitocondriale, ed interagiscono con altre proteine codificate dal mtDNA. Pertanto, la correlazione funzionale e patologica delle proteine mitocondriali con quelle mitocondriali ma codificate dal nucleo, rientra nelle finalità del progetto mt-HPP.
Tabella 5: Partecipanti italiani al progetto mt-HPP
Nome Istituto
Andrea Urbani, Luisa Pieroni, Enrico Cilio Università Roma Tor Vergata Maurizio Ronci Università D’Annunzio, Chieti Luigi Bonizzi, Paola Roncada, Alessio
Soggiu, Cristian Piras, Isabella Alloggio
Università Milano
Mauro Fasano, Tiziana Alberio, Heather Bondi, Mara Zilocchi, Chiara Monti
Arsizio (Va) Armando Negri, Gabriella Tedeschi Università Milano
Fulvio Magni, Clizia Chinello Università Milano-Bicocca, Monza
Andrea Di Fonzo, Giampaolo Merlini, Francesca Lavatelli
Policlinico S. Matteo, Pavia
Silvia Rocchiccioli IFC-CNR, Pisa
Antonio Lucacchini, Laura Giusti,
Federica Ciregia Università di Pisa
Vito De Pinto Università di Catania, Dip. Vincenzo Cunsolo, Rosaria Saletti, Vera
Muccilli
Università di Catania Roberto Scatena, Patrizia Bottoni Università Cattolica, Roma Cecilia Gelfi, Daniele Capitanio Università Milano
Diego Cigna CNR, Palermo
Italia Bongarzone INT, Milano
Roberta Pastorelli, Laura Brunelli, Silvia Giordano
Dario Di Silvestre ITB-CNR, Segrate Barbara Garavaglia, Valeria Tiranti,
Daniele Ghezzi
Besta, Milano ti, Piero Pucci , Margherita Ruoppolo,
Leila Birolo, Angela Amoresano, Andrea
Università Napoli
Claudio Bandi Università Milano
Davide Sassera Università Pavia
Gaia Maria Anelli, Chiara Novielli, Francesca Nardi
Università Milano, c/o Sacco Cristina Banfi, Maura Brioschi Centro Cardiologico Monzino
IRCCS
Maria Nicola Gadaleta, Clara Musicco Università Bari
Ist. Bioenergetica CNR
Il nostro laboratorio, come unità del mt-HPP (tabella 5), ha due compiti. Uno focalizzato sullo studio del coinvolgimento delle proteine mitocondriali in alcune patologie, l’altro incentrato nella generale caratterizzazione delle proteine espresse nel mitocondrio.
Per quanto riguarda il primo aspetto, siamo attualmente impegnati nello studio delle disfunzioni mitocondriali in diversi stati patologici ed in campioni biologici diversi:
le alterazioni riscontrate nelle cellule pancreatiche nel diabete di tipo 2 le disfunzioni mitocondriali in linfociti di pazienti affetti da disturbo
bipolare
il ruolo dei mitocondri nella sindrome da fatica cronica utilizzando le piastrine
Accanto a questo aspetto patofisiologico, abbiamo anche il compito di caratterizzare le proteine mitocondriali espresse in due linee cellulari da cui i mitocondri devono essere estratti secondo una metodica standardizzata e condivisa dal consorzio mt-HPP, e nello specifico le linee cellulari scelte sono
state:
le cellule H28, da cui i mitocondri devono essere estratti con centrifugazione in gradiente di densità
le cellule Hela, da cui i mitocondri devono essere estratti con un kit commerciale
Prima di tutto, per ogni aspetto del progetto, abbiamo dovuto finalizzare le condizioni sperimentali ottimali utili per l’estrazione di mitocondri. L’isolamento mitocondriale è piuttosto problematico dal momento che questi organelli hanno una correlazione molto stretta con altri compartimenti sub- cellulari e con il citoscheletro. Pertanto, anche se i mitocondri vengono frazionati, le proteine contaminanti provenienti soprattutto dal reticolo endoplasmatico e dalla membrana plasmatica, non possono essere del tutto escluse dai campioni, per questo si preferisce parlare di arricchimento mitocondriale piuttosto che di isolamento.
Per quanto riguarda la prima parte del progetto, è stata scelta la centrifugazione differenziale come tecnica di isolamento dei mitocondri, varia però la modalità di estrazione degli organelli dai diversi tipi cellulari.
Per lo studio sul diabete di tipo 2 abbiamo al momento analizzato cellule INS- 1E di ratto, per poi passare alle cellule umane, ed i mitocondri sono estratti dopo rottura meccanica delle cellule pancreatiche con potter. Nel caso dei linfociti, al trattamento con potter va aggiunta anche la sonicazione, vista la resistenza di questo tipo cellulare alla rottura. Infine, per le piastrine si è optato per l’utilizzo di un tampone di lisi. Come riportato in materiali e metodi (vedi cap.2 , par 2.2), all’estrazione segue poi la centrifugazione differenziale.
La purezza delle frazioni cellulari ottenute è stata valutata tramite western blot utilizzando un cocktail di anticorpi specifici per le varie frazioni cellulari. In figura 17 è riportata l’immunoreattività delle frazioni mitocondriali ottenute da ogni tipo di cellula.
Figura 17:Bande immunoreattive ottenute dal western blot relative alle frazioni citosolica (proteina gliceraldeide 3 fosfato deidrogenasi; 36 kDa) e mitocondriale (proteina ATP5A; 55 kDa).
Come si può osservare, la preparazione mitocondriale presenta una banda immunoreattiva a PM 55 kDa corrispondente alla proteina mitocondriale ATP5A e solo una debole contaminazione da citoplasma, come dimostrato dalla banda a 36 kDa della gliceraldeide3 fosfato deidrogenasi. Avendo confermato l’arricchimento della preparazione mitocondriale, si potrà quindi procedere con la sperimentazione analizzando il contenuto proteico della
frazione mitocondriale mediante due tecniche proteomiche complementari: elettroforesi bidimensionale e label-free shotgun. Successivamente saranno confrontati i pattern proteici dei malati con quelli dei controlli appropriati per ogni patologia in esame.
Per la seconda parte del progetto mt-HPP, abbiamo dovuto mettere a punto la centrifugazione in gradiente per l’arricchimento dei mitocondri da cellule H28, e testare un kit commerciale (Sigma) su un altro modello cellulare: le cellule HeLa.
Il consorzio mt-HPP ha infatti assegnato ai diversi gruppi italiani coinvolti, linee cellulari differenti. Inoltre per ogni linea cellulare è stata anche scelta una diversa tecnica di estrazione dei mitocondri, come schematizzato nella figura 18.
Figura 18: Gruppi italiani coinvolti nell’estrazione dei mitocondri dai modelli cellulari selezionati. Come si può vedere il nostro laboratorio (Giusti) ha il compito di estrarre i mitocondri dalle HeLa con il kit commerciale, e dalle H28 con la centrifugazione in gradiente
Una volta ottenuta la frazione mitocondriale arricchita, questa andrà analizzata mediante spettrometria di massa (proteomica shotgun) da un diverso gruppo coinvolto nel progetto. Lo scopo è quello di creare un network di collaborazione e scambio con tutti i gruppi italiani coinvolti.
Come si può vedere nella figura 19, i mitocondri che abbiamo estratto dalle HeLa col kit commerciale andranno inviati per l’analisi di massa al gruppo di Napoli del professor Pucci (Università degli Studi di Napoli Federico II). Mentre la frazione mitocondriale ottenuta dalle H28 sarà analizzata all’Università di Milano dal gruppo del professor Magni (Università degli Studi di Milano-Bicocca).
Figura 19:schema riassuntivo del network di destinazione dei mitocondri per l’analisi con spettrometria di massa
metodo di estrazione dei mitocondri tramite centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio. Il punto di partenza è stato il protocollo Pieroni, standardizzato dal gruppo Urbani, presente nel progetto mt-HPP, sulla linea cellulare HeLa. Naturalmente il protocollo deve essere modificato e ottimizzato a seconda della linea cellulare in esame, soprattutto per quanto riguarda la rottura delle cellule. Prima di procedere all’estrazione dei mitocondri dalle cellule H28, abbiamo eseguito una prova di centrifugazione in gradiente di densità sul fegato di un ratto. Sono state testate due differenti modalità di gradiente discontinuo: uno formato da saccarosio 1,6 M e saccarosio 1,2 M, l’altro da saccarosio 1,6 M e 1 M, concentrazioni diverse di saccarosio che si riflettono in diverse densità. Il punto importante è che i mitocondri si stabilizzino all’interfaccia del gradiente in base alla loro densità, che in generale si aggira su 1.17-1.21 g cm-3.
Tabella 6: Densità dei componenti subcellulari in soluzioni di saccarosio.
Dopo il sacrificio dell’animale, il fegato è stato omogenizzato con il potter e sottoposto ad una serie di centrifugazioni differenziali, che hanno portato al pellet arricchito in mitocondri da stratificare sul gradiente di saccarosio. Dopo l’ottenimento finale dei mitocondri, la loro purezza è stata valutata mediante western blot. L’immagine delle bande immunoreattive mostra una buona frazione mitocondriale e la presenza di membrane plasmatiche a PM più alti. Non sono visibili evidenti differenze di arricchimento utilizzando le due diverse concentrazioni di saccarosio, quindi abbiamo deciso di attenerci al protocollo Pieroni.
Figure 20: Bande immunoreattive relative alla prova su ratto con differenti gradienti di
densità: (a) con saccarosio 1 M, (b) con saccarosio 1.2 M.
Dopo questo controllo, siamo passati alle cellule H28 ed abbiamo cercato di ottimizzare il numero di strokes da eseguire con il potter. Le prime prove sono
state compiute utilizzando il numero di strokes previsti dal protocollo, cioè 25. Dopo visualizzazione al microscopio abbiamo verificato che la rottura delle cellule era insufficiente. Abbiamo quindi aggiunto un passaggio di sonicazione. Il western blot ha dato il risultato mostrato in figura 21: sono visibili la banda dei mitocondri a 55 kDa, la banda del citosol a 36 kDa e una doppia banda a PM bassi che rivela la presenza di istoni nucleari (anticorpo anti-Histone H3 MW = 15.5 kDa). Questo dato fa supporre che probabilmente la sonicazione abbia rotto anche i nuclei e le membrane nucleari si siano stratificate nel gradiente insieme ai mitocondri a causa della densità simile.
Figure 21: Western blot della frazione mitocondriale da H28 ottenuta aggiungendo la
sonicazione.
Abbiamo infine standardizzato il metodo utilizzando 45 strokes e l’analisi western blot della frazione mitocondriale arricchita fornisce i risultati in
figura 22.
Figure 22: Bande immunoreattive della frazione mitocondriale da H28 ottenuta
aumentando il numero degli strokes.
Sono presenti una banda leggera dei mitocondri e la banda del citosol a PM inferiore. Non si vede più la banda degli istoni a circa 20 kDa, quindi non abbiamo rotto i nuclei. La banda della proteina gliceraldeide 3fosfato deidrogenasi risulta evidente in quasi tutte le preparazioni mitocondriali che abbiamo svolto. Questo dato può far pensare che non siamo riusciti a pulire bene la frazione mitocondriale dal citosol, che viene rilevato dalla notevole immunoreattività della banda a 36 kDa. Dati presenti in letteratura riportano tuttavia che GAPDH, gliceraldeide 3 fosfato deidrogenasi, enzima glicolitico che si ritiene risiedere esclusivamente nel citosol, in condizioni di stress ossidativo traslochi nei mitocondri, dove si accumula e gioca un ruolo chiave nell’apoptosi. Essendo le cellule H28 una linea tumorale, è probabile che il fenomeno dello stress ossidativo sia importante, e che possa avvenire quindi la traslocazione dell’enzima GAPDH nei mitocondri.
Possiamo fare una verifica utilizzando due markers citosolici diversi dalla gliceraldeide 3 fosfato deidrogenasi: la transaldolasi e la ciclofilina A, che danno bande rispettivamente a 38 kDa e a 18 kDa.
Figure 23: western blot utilizzando gli anticorpi verso le proteine citosoliche transaldolasi
e ciclofilina A.
Come vediamo in figura 23, non sono visibili bande che riconoscano la proteina citosolica transaldolasi e la ciclofilina A. Il risultato è positivo, e quindi si può pensare che la GAPDH non sia indicativa di un inquinamento da citosol.
La seconda parte del progetto mt-HPP prevede di testare un kit commerciale (Sigma) per l’estrazione dei mitocondri dalla linea cellulare HeLa. Come da protocollo, una volta ottenute le cellule per tripsinizzazione, abbiamo svolto la lisi cellulare con le soluzioni fornite dal kit e dopo due centrifugazioni differenziali abbiamo ottenuto il pellet dei mitocondri. Il pellet è stato risospeso con Storage Buffer, al fine di mantenere l’integrità dei mitocondri, e
l’analisi western blot utilizzando il cocktail di anticorpi ha mostrato il risultato in figura 24.
Figure 24: Bande immunoreattive del western blot sulla preparazione mitocondriale da
cellule HeLa.
Sono visibili la banda dei mitocondri a 55 kDa, le membrane plasmatiche a 113 kDa, la banda intensa del citosol a 36 kDa, mentre la banda dei nuclei a circa 15 kDa risulta debole. Questo kit non risulta particolarmente efficiente nell’arricchimento mitocondriale ma ha l’unico vantaggio di essere rapido. I pellet di mitocondri (n=3, triplicato biologico) che abbiamo estratto dalle HeLa col kit commerciale sono stati inviati per l’analisi di massa al gruppo di Napoli del professor Pucci (Università degli Studi di Napoli Federico II) che valuterà l’effettivo arricchimento in proteine mitocondriali e quindi l’efficacia di tale protocollo.
L’arricchimento mitocondriale è molto complesso perché questi organelli presentano forti interazioni con altri compartimenti subcellulari e il
citoscheletro. Inoltre, anche se i mitocondri vengono ben frazionati, contaminanti proteici, provenienti in particolare dal reticolo endoplasmatico e dalla membrana di altri organelli quali i lisosomi, che presentano densità vicine a quella del mitocondrio, non possono essere completamente esclusi. L’esito dell’analisi in spettrometria di massa sui nostri campioni ci darà un’indicazione dell’arricchimento della frazione mitocondriale ottenuta per le diverse preparazioni. I risultati dei vari componenti di consorzio confluiranno in metodologie comuni da seguire, sia per la preparazione dei mitocondri, oggetto di studio del progetto mt-HPP, sia per la successiva analisi in spettrometria di massa e permetteranno di stabilire quali metodologie seguire nella preparazione dei mitocondri oggetto di studio dell’mt-HPP.
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Ringraziamenti
Un doveroso ringraziamento al Prof. Antonio Lucacchini ed alla Dott.ssa Laura Giusti che mi hanno permesso di realizzare questo lavoro di tesi nel loro laboratorio di proteomica. Alla Dott.ssa Federica Ciriegia e alla dottoranda Claudia Boldrini che sono state sempre presenti e disponibili in laboratorio seguendomi nel lavoro pratico di tesi ed aiutandomi nella stesura di questo lavoro.
Un grazie di cuore alla mia colonna portante, papà Francesco, che mi ha permesso di studiare e di raggiungere un traguardo cosi importante, incoraggiandomi ogni giorno; ringrazio mio fratello Marco che essendoci passato per prima mi ha sempre sostenuta e capita...e qualche volta anche sopportata.
Un grazie speciale va anche ai miei zii, Patrizio, Pina, Manuela e Pino che hanno sempre creduto in me facendomi sentire più di una nipote.
Dicono che gli amici sono la famiglia che ti scegli ed è vero...voglio ringraziare di cuore le mie 4 amiche e colleghe, Elena, Martina, Elisa e Marta che mi hanno regalato dei momenti bellissimi, dentro e fuori dalle mura universitarie; sono stati anni con alti e bassi, fiera di averli vissuti con voi lottando e senza perdersi d'animo.
Un grazie particolare alla mia migliore amica Sara che conosco da più di 20 anni e che per è quasi come una sorella; alla mia spalla, Mariagrazia, che mi ha sempre incoraggiata e sostenuta; e poi ancora Gabriele, Michele e Marco che non smettono mai di strapparmi una risata o un sorriso. Grazie ancora a Valentina, MariaLinda, Maruska, Sara, Federica, Stefano, Davide, Carlo, Giulio, Alberto, Laura e tanti altri…
parole per capire e per spiegare. Avrei voluto condividere questo momento