Questo studio porta avanti un lavoro precedente, svolto nei nostri laboratori, sull’alterazione delle proteine mitocondriali nelle cellule beta del pancreas nel diabete di tipo 2.
Il diabete mellito è una complessa patologia metabolica caratterizzata da iperglicemia cronica dovuta alla mancanza di insulina. Il diabete può essere suddiviso in due forme principali: tipo 1 e tipo 2.
Il diabete di tipo 1 origina dalla distruzione autoimmune delle cellule beta del pancreas secernenti insulina. Il diabete di tipo 2 è invece un disordine metabolico caratterizzato dalla carenza di insulina dovuta ad una ridotta secrezione da parte delle cellule beta e/o da una riduzione degli effetti dell’insulina nei tessuti bersaglio.
La prevalenza del diabete di tipo 2 è in crescita, in parte a causa dell’incremento dei tassi di obesità che rappresentano un importante fattore di rischio per la malattia. Infatti fattori ambientali come una vita sedentaria legata a una dieta ricca di grassi saturi, combinati ad una predisposizione genetica, contribuiscono al danno alle cellule beta. Questo effetto dannoso degli acidi grassi sulla corretta funzionalità pancreatica è noto come lipotossicità(53). Dal momento che il palmitato è l’acido grasso saturo più comune nel plasma, il palmitato è stato spesso utilizzato per studi in vitro
50 sulla lipotossicità. E’ stato dimostrato che il trattamento delle cellule beta con palmitato ostacola la secrezione di insulina, e determina morte cellulare. Alcuni studi hanno suggerito che il palmitato induca la morte delle cellule beta mediante l’attivazione della via mitocondriale dell’apoptosi e sembra che il diabete possa dipendere da alterazioni mitocondriali. Infatti, difetti nella funzionalità mitocondriale ostacolano l’accoppiamento del metabolismo del glucosio con la secrezione di insulina e in ultima analisi promuovono l’apoptosi delle cellule beta.
Per questo, in uno studio precedente condotto nei nostri laboratori (54), abbiamo studiato l’effetto lipotossico del palmitato sui mitocondri isolati da cellule beta INS-1E di ratto con due approcci proteomici: elettroforesi bidimensionale e shotgun, evidenziando una variazione nell’espressione di proteine mitocondriali. Ma la relazione causale tra l’alterazione mitocondriale e la lipotossicità non sono noti. Un’ipotesi è che il palmitato attivi delle modificazioni post-traduzionali. In effetti, queste modificazioni hanno un ruolo fondamentale nella regolazione delle funzioni biologiche cellulari.
Lavori recenti hanno suggerito l’acetilazione delle lisine come un fattore importante nella regolazione metabolica, soprattutto nei mitocondri. In generale, i livelli di acetilazione e deacetilazione oscillano tra stato di
51 digiuno e alimentazione, e probabilmente riflettono i cambiamenti nella selezione del carburante disponibile per la produzione di energia.
La nostra ipotesi è pertanto che elevati livelli di acidi grassi possano incrementare il contenuto di acetil-CoA, attraverso la beta-ossidazione, ed il rapporto NADH/NAD+.
L’aumento dell’acetil-CoA, donatore di carbonio per l’acetilazione delle lisine, potrebbe favorire l’acetilazione. Mentre l’incremento del rapporto NADH/NAD+ potrebbe ostacolare l’attività della sirtuina 3, una deacetilasi mitocondriale che utilizza il NAD+ come cofattore.
Questa idea era stata suggerita già dal primo lavoro condotto nei nostri laboratori. Infatti, come si può vedere nella figura 2.7 con l’elettroforesi bidimensionale, tra gli spot differenzialmente espressi nelle cellule trattate con palmitato, osservavamo la presenza di due spots molto vicini, entrambi identificati come la glutammato deidrogenasi mitocondriale. La presenza dello spot più acido, solo nelle cellule trattate con palmitato, ci aveva fatto supporre che si trattasse della glutammato deidrogenasi acetilata e pertanto inattiva.
52 Figura 2.7: Immagine ingrandita dello spot corrispondente alla glutammato deidrogenasi, di cui si sono trovati due spot vicini nei mitocondri da cellule INS-1E trattate con palmitato 0.5mM
24h.
Quindi, sull’onda di questi risultati preliminari, abbiamo proseguito lo studio analizzando, con western blot, l’acetilazione sulle proteine mitocondriali estratte dalle cellule INS-1E di ratto, con e senza trattamento con palmitato. Abbiamo effettuato l’elettroforesi bidimensionale delle proteine mitocondriali estratte dalle INS-1E e successivamente il western blot dei gel. Confrontando con t-test la densità ottica degli spots ottenuti dalle cellule senza trattamento, con quella degli spot delle cellule trattate, abbiamo riscontrato un aumento nei livelli di acetilazione di diverse proteine nel caso del trattamento con palmitato. Queste proteine sono state tagliate dal gel ed identificate tramite spettrometria di massa. La tabella 2.8 riporta ID (codice uniprot di riferimento della proteina), punto isoelettrico (pI), massa molecolare (MW) e dati di massa delle proteine identificate (score= indica quanto esattamente lo spettro di massa coincida con il peptide; coverage%= indica la percentuale della sequenza proteica che rappresenta la proteina identificata).
53 Tabella 2.8. Proteine identificate con spettrometria di massa trovate maggiormente
acetilate nelle cellule INS-1E trattate con palmitato N° Name ID pI MW score cov %
7 Aconitase Q9ER34 8.7 86 96 4.4 8 Aconitase Q9ER34 8.7 86 246.7 7.6 12 VDAC2 P81155 8.7 32 74 13 23 GDH P10860 8.8 62 186 10 24 PRDX1 Q63716 8.3 22 41.7 20 25 ATP synth delta P35434 5 18 99.6 13.7 26 Pyruvate DH P26284 9.4 44 25.5 6
Con il presente lavoro di tesi abbiamo poi deciso di trasferire questi risultati dalle INS-1E di ratto all’umano. Pertanto abbiamo proceduto utilizzando campioni di cellule beta ottenute da pancreas umano, anche in tal caso abbiamo confrontato cellule trattate 24h con palmitato 0.5mM con cellule senza trattamento. Nel caso delle cellule umane non abbiamo potuto estrarre i mitocondri, dato l’esiguo numero di cellule che si riescono ad ottenere, ovvero circa 30mila, quindi abbiamo processato il contenuto proteico totale delle cellule.
Le proteine estratte dalle cellule umane sono state sottoposte ad elettroforesi bidimensionale e successivamente trasferite su filtro di nitrocellulosa. L’uso dell’anticorpo specifico per le lisine acetilate ha evidenziato la presenza delle proteine acetilate.
54 La figura 1A riporta l’immagine del gel bidimensionale ottenuto dalle cellule trattate con palmitato (prima dimensione su strip a gradiente di pH 3-10 lineare; seconda dimensione su gel di poliacrilamide al 12.5%); la figura 1B raffigura la membrana di nitrocellulosa, dopo il trasferimento delle proteine, colorata al rutenio; infine la figura 1C illustra la stessa membrana della figura 1B dopo lo sviluppo degli immunocomplessi. Ogni spot di questa immagine rappresenta quindi una proteina acetilata. Chiaramente si è proceduto in modo analogo anche con le cellule senza trattamento.
Gli esperimenti sono stati effettuati in triplicato ed abbiamo confrontato l’intensità degli spot tra cellule trattate e non trattate, normalizzando i valori col contenuto proteico totale ricavato dalla nitrocellulosa colorata al rutenio.
55 Figura1. Elettroforesi bidimensionale e western blot. 1A gel bidimensionale colorato al rutenio 1B nitrocellulosa colorata al rutenio dopo il trasferimento delle proteine
1C membrana di nitrocellulosa dopo
sviluppo dell’anticorpo anti-lisina acetilata. I
cerchi rossi evidenziano gli spot acetilati
Gli istogrammi della figura2.9 riportano le differenze significative ottenute dal confronto. Quindi si è evidenziato che, eccettuati tre spots, si otteneva un incremento di acetilazione dopo il trattamento con palmitato.
56 Figura 2.9.Gli istogrammi riportano i valori medi di intensità degli spots acetilati. Con n.s. si indicano gli spots la cui differenza è non significativa tra controllo e palmitato. Nel caso in cui manca la barra del controllo, non significata che la proteina corrispondente sia assente ma che sia assente la sua forma modificata.
In seguito, grazie al programma Image Master, è stato possibile confrontare esattamente la membrana 1C con la membrana 1B, in modo tale da ritrovare gli spots acetilati nella mappa bidimensionale totale e che abbiamo infine potuto rintracciare e tagliare dal gel 1A per l’identificazione con la spettrometria di massa. Al momento siamo in attesa dei risultati.
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 0.0 2.5 5.0 N° spot % V O L U M E
n.s.
n.s.
n.s.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0.0 2.5 5.0 7.5 % V O L U ME CONTROLLO PALMITATO57 Chiaramente non tutte le proteine acetilate saranno mitocondriali visto che abbiamo processato il contenuto proteico cellulare totale, ma dal confronto di queste mappe bidimensionali, ottenute da cellule umane, con quelle ottenute dai mitocondri di cellule INS-1E di ratto, abbiamo potuto ritrovare alcuni di questi spots proteici. Le immagini ingrandite di questi spots sono riportate nella figura3.0
Figura3.0 Immagini ingrandite degli spot acetilati che abbiamo ritrovato nelle cellule umane confrontando le immagini di quest’ultime con le immagini dei mitocondri delle INS-1E.
Tra le proteine acetilate abbiamo effettivamente trovato, come suggerito dal nostro precedente lavoro, la glutammato deidrogenasi mitocondriale (n°22 e 23). Questo è un enzima coinvolto nella deaminazione ossidativa necessaria nel metabolismo degli aminoacidi che è correlato alla produzione e secrezione di insulina. L’acetilazione della glutammato deidrogenasi ne determina una progressiva riduzione funzionale che quindi
CONTROLLO PALMITATO 22,23 25 7-9 Glutammato DH
ATP sintasi sub delta Aconitasi
58 potrebbe confermare l’effetto dannoso degli acidi grassi sulla secrezione di insulina.
Tra le proteine acetilate dopo trattamento con palmitato troviamo 3 isoforme della aconitasi (n°7, 8, 9). Studi recenti hanno messo in luce un incremento dell’attività di questo enzima mitocondriale in seguito ad acetilazione. Dato che l’aconitasi ha un ruolo centrale nel metabolismo del citrato, possiamo ipotizzare che questa attivazione acetilazione-dipendente rappresenti un modo per la cellula per incrementare l’utilizzo degli acidi grassi come fonte energetica, tramite la beta ossidazione, quando c’è disponibilità di lipidi.
Infine, troviamo acetilata, nelle cellule trattate con palmitato, una subunità dell’ATP sintasi. L’ATP è necessario per l’incremento della concentrazione citosolica del calcio, richiesto per la secrezione di insulina. L’acetilazione dell’ATP sintasi potrebbe, almeno in parte, essere responsabile della diminuzione della produzione di ATP visto che l’acetilazione riduce l’attività catalitica di questo enzima mitocondriale. In effetti è stato spesso proposto che il palmitato possa ridurre la produzione di ATP interferendo quindi con una corretta funzionalità mitocondriale.
In conclusione, questi dati preliminari sembrano supportare l’ipotesi che un cambiamento nello stato di acetilazione delle proteine mitocondriali potrebbe contribuire allo sviluppo del diabete di tipo 2. Infatti, il palmitato
59 potrebbe effettivamente esercitare la sua azione lipotossica incrementando l’acetilazione. Comunque, il meccanismo molecolare che regola l’acetilazione delle lisine deve essere chiarito. In futuro, ad esempio, potremmo dimostrare che gli acidi grassi sono la fonte diretta delle unità acetile utilizzando palmitato marcato radioattivamente.
Studi successivi che identifichino i target proteici acetilati potrebbero chiarire i meccanismi mediante i quali una disfunzione metabolica conduce alla perdita della corretta funzionalità mitocondriale ed alla progressione del diabete.
60
Abbreviazioni
AMPK-proteina chinasi AMP-attivata ADP-adenosina difosfato
ATP-adenosina trifosfato RE-reticolo endoplasmatico DAG-diacilglicerolo
IR-insulino resistenza
IRS-substrati del recettore insulinico HDL-lipoproteine ad alta densità LDL-lipoproteine a bassa densità CAD-chetoacidosi diabetica mtDNA-DNA mitocondriale
OMS-organizzazione modniale della sanità BMI-indice della massa corporea
ROS-specie reattive dell’ossigeno RS-soluzione di reidratazione Rrna-RNA ribosomiale
SDS-sodio dodecil solfuro
MtPTP-poro di transizione mitocondriale AIF-apoptosis inducing factor
IPG-gradiente a pH immobilizzato OXPHOS-fosforilazione ossidativa DT1-diabete di tipo 1 DT2-diabete di tipo 2 GLP-1-glucagone-like-peptide 1 PI3K-fosfatidilinositolo 3-chinasi MS-spettrometria di massa IAA-iodioacetammide
61 DTT-ditiotreitolo
PBS-Tampone fosfato salino IEF-isoelettrofocalizzazione pI –punto isoelettrico
PM-peso molecolare WB-western blott
TWB-tampone western blot BSA-albumina bovina
62
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