La proteomica si è rivelata uno strumento utile nella clinica traslazionale (che indica l’approccio secondo cui l’ obiettivo della ricerca sia la trasformazione dei risultati ottenuti in applicazioni cliniche) aprendo nuove prospettive per un aiuto nella diagnosi in patologie che finora non sono state supportate da analisi strumentali e di laboratorio, oltre per una più facile scelta nell’utilizzo della terapia e nel suo monitoraggio.
Questo è particolarmente vero per le patologie psichiatriche dove attualmente i sistemi di classificazione utilizzati non sono basati su dati oggettivi e molti dei criteri diagnostici vanno a sovrapporsi tra i diversi disordini, principalmente perché i questionari che si prefiggono l’obiettivo di differenziare le patologie psichiatriche si basano su punteggi riferiti alle risposte date dai soggetti durante l’intervista clinica, sono pertanto mutevoli a seconda dell’emotività momentanea.
Ma, nonostante i progressi fatti negli ultimi anni, nell’ambito dello studio delle patologie psichiatriche, a causa anche della complessità delle stesse, la sfida è ancora aperta.
L’identificazione di marcatori biologici potrebbe migliorare la diagnosi e favorire la classificazione di questi disordini psichiatrici e la stratificazione dei pazienti in gruppi omogenei, per poter creare sottopopolazioni differenziabili sia da un punto di vista diagnostico che terapeutico.
40
Con questo fine nel laboratorio di ricerca dove ho condotto il mio lavoro di tesi, è stato utilizzato un approccio proteomico per studiare pazienti con episodio psicotico nell’ambito di un disturbo bipolare.
I risultati ottenuti da L. Giusti, V. Mantua, Y. Da Valle, F. Ciregia et al.[26] hanno confermato l’affidabilità della scelta dei linfociti come modello sperimentale per lo studio di disordini psichiatrici e suggerito un pannello di potenziali proteine in grado di differenziare i diversi profili dei pazienti affetti da disturbo bipolare. Scopo del mio lavoro di tesi è stato quello di condurre la validazione di queste proteine in un gruppo di pazienti affetti da BD.
Il mio lavoro si inserisce in un progetto più ampio che prevede l’arruolamento di circa 100 pazienti BD sui quali valutare la differenza di espressione delle proteine definite precedentemente e vederne la correlazione con parametri clinici tali da essere di aiuto nella complessità del profilo bipolare.
Le proteine oggetto di validazione sono state : STIP1, LASP1, TPD52L2, 14.3.3, ApoA1, TPI, Aptoglobina, proteine citoplasmatiche le cui caratteristiche principali sono riportate di seguito:
• Stress-induced-phosphoprotein 1 (STIP1): serve alla coordinazione tra le due proteine HSP70 e HSP90, le quali svolgono un ruolo essenziale nel ripiegamento delle proteine a livello del citosol; hanno il ruolo di “chaperones molecolari” ovvero molecole che si occupano della prevenzione di associazioni non corrette o aggregazione di catene polipeptidiche non ripiegate, sia in condizioni fisiologiche che in condizioni di stress[29];
• LIM and SH3 domain protein 1 (LASP1): fa parte di un meccanismo di trasduzione del segnale che coinvolge come secondi messaggeri cAMP e
cGMP ed interessa la costruzione del citoscheletro e delle estensioni
41
proliferazione cellulare è risultata essere un buon biomarcatore per
alcuni tipi di tumore[28];
• Tumor Protein D54 (TDP52L2): è un membro della famiglia D52 di proteine tumorali che legano ioni Ca++ all’Annessina, una proteina calcio- dipendente coinvolta nei meccanismi di esocitosi e di endocitosi tramite vescicole nelle cellule del plasma[31];
• 14-3-3 Protein z / δ (14-3-3): è una proteina adattatrice con attività di modulazione, coinvolta in moltissime vie di segnalazione e trasduzione del segnale, si accoppia a molte famiglie proteiche, legandosi ai residui di fosfoserina e fosfotreonina[32];
• Apolipoprotein A-1 (ApoA-1): è il componente proteico principale delle lipoproteine HDL, la cui funzione è il trasporto inverso del colesterolo (lo trasporta dai tessuti periferici verso il fegato)[33];
• Triosephosphate isomerasi (TPI): si tratta di un enzima citosolico che catalizza la trasformazione del diidrossiacetonefosfato in gliceraldeide 3- fosfato all’interno della glicolisi, processo metabolico che serve a formare molecole ad alta energia immediatamente spendibili dalla cellula (ATP e NADH) a partire da una molecola di glucosio[30];
• Aptoglobina: si tratta di una mucoproteina, fa parte della famiglia proteica la cui funzione principale è quella di lubrificare e proteggere i tessuti da insulti meccanici o biologici, infatti ha come funzione principale quella di protezione dei tessuti dallo stress ossidativo causato dal gruppo EME dopo i meccanismi di emolisi[34][35].
La validazione è stata condotta attraverso analisi Western Blot utilizzando anticorpi specifici su campioni di citosol ottenuti da centrifugazione differenziale dei linfociti di 13 pazienti bipolari e 6 soggetti sani.
42
I valori di immunoreattività di ogni proteina sono stati normalizzati sulle proteine totali e riportati su un grafico a barre che riporta il valore medio +/- la SEM del livello di espressione per singola proteina nei pazienti BD e soggetti sani (figura 4.1). Haptoglobin TPD52L2 ApoA1
*
**
**
Figura 4.1: immunoreazioni per campioni rappresentativi di BD, istogrammacorrispondente per anticorpi ad Haptoglobin, TDP52L2 e ApoA1
43
L’analisi statistica parametrica è stata condotta utilizzando uno Student t Test per dati non appaiati (*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001).
Come è possibile notare, un incremento di espressione significativo è stato trovato nei pazienti BD per ApoA1, TPD e Aptoglobina rispettivamente nell’ordine di circa 40, 2 e 10 volte rispetto ai sani, mentre una riduzione di espressione nei pazienti affetti da BD rispetto al gruppo di soggetti sani è stata riscontrata per le proteine 14-3-3 e TPI con ordini di grandezza rispettivamente di 2,4 e 2,6 volte. TPI 14-3-3 Figura 4.2: immunoreazioni per campioni rappresentativi di BD, istogramma corrispondente per anticorpi ad 14-3-3 e TPI
**
***
44
L’andamento di espressione ritrovato per queste proteine nei nostri pazienti conferma quello riportato precedentemente nel lavoro condotto da Giusti et
al.[26]
Come già suggerito gli incrementi di espressione di ApoA1 e Aptoglobina, riscontrati non solo in soggetti bipolari ma anche in pazienti con depressione maggiore, potrebbero essere associati ad una risposta infiammatoria indotta in modo diretto o indiretto da citochine pro-infiammatorie quali IL-8[26] (figura 4.3).
Figura 4.3: pathway infiammatorio
D’altro canto ApoA1 e Haptoglobina sono proteine sieriche, il fatto di ritrovarle nella nostra preparazione di citosol da linfociti potrebbe essere una
conseguenza di fenomeni di internalizzazione a seguito di interazioni con le cellule come riportato da Herbert et al. nei PBMC e Politi et al per le cellule endoteliali[39][40].
45
Risultati contrastanti sono stati riscontrati per le proteine LASP1 e STIP1.
Queste proteine non risultano differenzialmente espresse in modo significativo nel gruppo di soggetti BD rispetto ai soggetti sani (figura 4.4).
Questo risultato risulta interessante alla luce del fatto che queste proteine insieme ad ACAD (Acyl CoA Dehydrogenase), un enzima mitocondriale
essenziale nel processo di ossidazione degli acidi grassi, risultavano in grado di discriminare la popolazione di pazienti psicotici con spettro BD non solo rispetto soggetti sani ma anche al gruppo di controllo patologico costituito da pazienti con depressione maggiore.
In questo studio di validazione ci troviamo di fronte a 13 pazienti affetti da disturbo bipolare ma solo quattro di questi (tabella 3.1, capitolo 3) presentano
LASP1 STIP1 Figura 4.3: immunoreazioni per campioni rappresentativi di BD, istogramma corrispondente per anticorpi a STIP1 e LASP1
n.s.
46
nella storia di malattia la comparsa di un episodio depressivo o misto, comunque non al momento del prelievo.
LASP1 è una proteina molto versatile e grazie alla sua struttura a multi domini è in grado di interagire con numerose altre proteine partner giocando ruoli chiave nella struttura e nel segnale cellulare e nei processi fisiologici.
STIP1 è una chaperonina e i suoi valori di espressione variano in risposta a diverse condizione di stress.
Come è evidenziato nel pathway (figura 4.3) esiste una relazione tra questa proteina e gli ormoni peptidici LH e FSH per i quali è stato osservato una correlazione tra il loro incremento e gli effetti collaterali del disturbo bipolare quali episodi depressivi, maniacali e aggressivi. La stretta correlazione tra l’incremento di espressione di queste due proteine, riscontrato nello studio precedente, e la manifestazione di un episodio psicotico (depressivo, maniacale o misto) nell’ambito di un disturbo bipolare, potrebbe trovare conferma nella mancata differenza di espressione significativa riscontrata per queste due proteine nel gruppo di pazienti bipolari studiati in questo percorso di tesi e rafforzerebbe ancora di più l’esistenza di risposte specifiche a profili specifici che potrebbero aiutarci nella diagnosi e nella scelta della terapia dei pazienti affetti da disordine bipolare.
47
BIBLIOGRAFIA
[1] M. Di Fiorino, G.J. Massei, A. Del Debbio “Psicoeducazione nel Disturbo Bipolare” ediz.
Psichiatria & Territorio, 2012.
[2] M. Rinaldi “I quattro temperamenti” APSA Il_temperamento%20ed%20il%20carattere.htm [3]E. Kraepelin “Trattato di psichiatria” 1921. Traduzione della VII ediz. Di G. Guidi, A.
Tamburini.
[4] T.A. Ketter, P.W. Wang “Diagnosis and Treatment of Bipolar Disorder” V ediz. American
Psychiatric Pubblishing Inc., 2013
[5] A.F. Carvalho, Y. Takwoingi, P.M.G. Sales, J.K. Soczynska et al. “Screening for bipolar
spectrum disorder: a comprehensive meta-analysis of accuracy studies” Journal of Affective
Disorders, 172 (2015) 337-346, 2014.
[6] R.C. Kessler, P. Berglund; W.T.Chiu, O. Demler et al. “The US National Comorbidity Survey
Replication (NCS-R): design and field procedures” International Journal of Methods in
Psychiatric Research, vol. 13, n. 2 69-92.
[7] S. Miller, B. Dell’Osso, T.A. Ketter “The prevalence and burden of bipolar depression”
Journal of Affective Disorders, 162 S1 (2014) S3-S11, 2014.
[8] L.L. Altshuler, P.W. Kupka, G. Hellemann, M.A. Frye et al. “Gender and depressive
symptoms in 711 patients with bipolar disorder evaluated prospectively in the Stanley Foundation bipolar treatment outcome network” The American Journal of Psychiatry, vol. 167, 8, pp. 708-715, 2010.
[9] K. Latalova, J. Prasko, A. Grambal, P.Havlikova et al. “Bipolar disorder and anxiety disorders”
Nuroendocrinology Letters, 2013; 34(8): 738-744, 2013.
[10] A. Fagiolini, R. Forgione, M. Maccari, A. Cuomo et al. “Prevalence, chronicity, burden and
borders of bipolar disorder” Journal of Affective Disorders, 148 (2013) 161-169, 2012.
[11] American Psychiatric Association “Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,
48
[12] A. Rainone, L. Marras, A. Chichierichia “Quale ruolo per la psicoterapia nella cura del
disturbo bipolare? La Terapia Cognitivo-Comportamentale” http://www.apc.it/wp-
content/uploads/2010/02/Quale-ruolo-per-la-psicoterapia-nella-cura-del-DB-TCC.pdf
[13] J.H. Gijsman, J.R. Geddes, J.M. Rendell, W.A. Nolen, G.M. Goodwin “Antidepressants for
bipolar depression : a systematic review of randomized, controlled trials” PubMed PMID:15337640, 2004.
[14] G.S. Sachs, A.A. Nierenberg, J.R. Calabrese, L.B. Marangell et al. “Effectiveness of
adjunctive antidepressant treatment for bipolar depression” New England Journal of Medicine 2007, 356: 1711-1722.
[15] C.B. Nemeroff, D.L. Evans, L.Gyalai, G.S.Sachs et al. “Double-blind, placebo-controlled
comparison of imiramine and paroxetine in the treatment of bipolar depression” PubMed PMID:11384898, 2001.
[16] G.S. Sachs “Bipolar mood disorder: practical strategies for acute and mainteinance phase
treatment” Journal of Clinical Psychopharmacology 31, pp. 1841-1853, 2006
[17] G.S. Sachs “Decision tree for the treatment of bipolar disorder” Journal of Clinical
Psychiatry 16, 32S-46S, 1996.
[18] M.B. Keller “Improving the course of illness and promoting continuation of treatment of
bipolar disorder” Journal of Clinical Psychiatry 65/15, pp. 10-14, 2004
[19] A.C. Swann “Long-term treatment in bipolar disorder” Journal of Clinical Psychiatry 66/1,
pp. 7-12, 2005
[20] S. Licoccia “Spettrometria di Massa” Lezione online dell’Università di Roma corso di Misure
Ambientali http://www.uniroma2.it/didattica/MA2/deposito/spettrometria_massa.pdf
[21] T. Rabilloud, C. Lelong “Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: a tutorial”
Journal of Proteomics, 74 (2011), pp. 1829-1841, 2011.
[22] A. Uccelli, G Novi “ Le cellule staminali del midollo osseo” Progetto Interuniversitario
Scienza Attiva, http://www.scienzattiva.eu/wp-
49
[23] A.K. Abban, A.H. Lichtman, S. Pillai “Immunologia cellulare e molecolare” VII edizione, ed.
Elsevier.
[24] R. Testi, V. Del Gobbo “Linfociti T” Lezione online dell’Università di Roma corso di
Immunologia http://www.uniroma2.it/didattica/Immunologia/deposito/linfociti_T.pdf
[25] J. R. de Jesus, B.K. de Campos, R. Moretto Galazzi et al. “Bipolar Disorder: recent advances
and future trends in bioanalytical development for biomarker discovery” Journal of Analytical
and Bioanalytical Chemistry (2015) 407, pp. 661-667, 2014.
[26] L. Giusti, V. Mantua, Y. Da Valle, F. Ciregia et al. “Search for peripheral biomarkers in
patients affected by acutely psychotic bipolar disorder: a protomic approach” Molecular
BioSystems 10, pp. 1246-1254, 2014.
[27] National Center for Biotechnology Information “LASP 1 LIM and SH3 protein 1 [Homo
Sapiens (human)]”
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=3927
[28] V. Schreiber, C. Moog-Lutz, C.H. Régnier, M.P. Chenard et al. “Lasp-1, a novel type of actin-
binding protein accumulating in cell membrane extensions” Molecular Medicine 4, pp. 675-
687, 1998.
[29] Y. Song, D.C. Masison “Independent regulation of HSP70 and HSP90 chaperones by
HSP70/HSP90-organizing protein STIP1 (HOP1)” Journal of Biological Chemistry 280 (40), pp.
34178-34185, 2005.
[30] P.M. Burton, S.G. Waley “The active centre of Triose Phosphate Isomerase” Journal of
Biochemistry (1966) 100, pp. 702-710, 1966.
[31] Abstract from: R. Boutros, S. Fanayan, M. Shehta, J.A. Byrne “The tumor protein D52
family: many pieces, many puzzles” Biochemical and Biophysical Research Communications
325, 4, pp. 1115-1121, 2004.
[32] Universal Protein Resource “P63104 - 1433Z_HUMAN” http://www.uniprot.org/uniprot
/P63104
[33] National Center for Biotechnology Information “APOA1 apolipoprotein A-1 [Homo Sapiens
(human)]”
50
[34] Abstract from: W. Dobryszycka “Biological functions of haptoglobin – new pieces to an old
puzzle” European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 35, 9, pp. 647-654,
1997.
[35] V. Peretti de Albuquerque Wobeto, T.R. Zaccariotto, M. de Fatima Sonati “Polymorphism
of human haptoglobin and its clinical importance” Genetics and Molecular Biology, 31, 3,
2008.
[36] P. Abrescia, L. Cigliano, C. Pedone, A. Salvatore, R.C. Pugliese “Identificazione della regione
dell’aptoglobina che sopprime la risposta immunitaria” Sezione di fisiologia ed igiene del
Dipartimento delle Scienze Biologiche, Università degli Studi di Napoli Federico II, http://www.dsb.unina.it/ricerca/LR09_fisig-08.html
[37] Schede di sicurezza Bio-Rad “Reagent I”, “Reagent II” “Reagent A” “Reagent B” “Reagent
S” http://www.bio-rad.com/it-it/product/rc-dc-protein-assay
[38] H.Towbin, T.Staehelin, J.Gordon “Electrophoretic transfer of proteins from polyscrylamide
gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications” Proceedings of the National
Academy of Sciences of USA, 76, 9, pp. 4350-4354, 1979.
[39] D.Herbert, P.J.Phipps, R.E.Strange “Chemical Analysis of Microbial Cells” Methods in
Microbiology, Volume 5-B, pp.209-344, ed. Elsevier, 1971.
[40] P.Politi, N.Brondino, E.Emanuele “Icreased proapoptotic serum activity in patients with
chronic mood disorders.” Archives of Medical Research, feb. 2008, 39 (2), pp. 242 – 245, 2008.
RINGRAZIAMENTI
Desidero innanzitutto ringraziare il Professor Lucacchini e la Dottoressa Giusti per avermi permesso di realizzare questo lavoro nel loro laboratorio di proteomica; la Dottoressa Federica Ciregia per avermi seguita durante questi mesi di esperimenti, guidata attraverso tutte le difficoltà di ritrovarsi in un ambiente totalmente nuovo e per tutto l’aiuto che mi ha dato durante il lavoro di stesura. Insieme a lei desidero ringraziare anche le dottorande Isabella e Claudia che con infinita pazienza hanno saputo aiutarmi per ogni problema. Un doveroso grazie lo devo a tutta la mia famiglia, soprattutto a mia mamma che mi ha sempre spronata e che in cinque anni ha speso qualche migliaio di euro in tisane rilassanti e cioccolata per le serate peggiori, grazie per avermi permesso di arrivare fin qui e grazie per aver sopportato che ogni giorno, da un mese a questa parte io non abbia parlato d’altro che di queste pagine, fino allo sfinimento.
Grazie agli amici conosciuti tra i banchi di corso tra cui Rachele e Leonardo che hanno condiviso con me la vita universitaria e quella al di fuori; un grazie speciale anche a Laura, che in laboratorio mi ha dato sostegno mentre io lo davo a lei.
Grazie mille a tutti gli amici di una vita che mi hanno accompagnata e sopportata in tutti i momenti “no”, grazie per ogni momento in cui con sessioni di gioco, caffè, chiacchere mi avete aiutata, a volte neanche sapendolo.
Un grazie in particolare ad Alessandro che in tutti questi anni non mi ha fatto mai mancare appoggio, grazie perché ogni “sono orgoglioso” è stato importante ed è stato una spinta, grazie per avermi “accompagnata”(come sai tu) ad ogni singolo esame. Insostituibile.
Inoltre vorrei ringraziare i farmacisti della Farmacia Vassallo di Camaiore per avermi mostrato il mestiere del farmacista e i farmacisti dell’ASL 12 Versilia per avermene mostrato un altro aspetto.
…grazie a tutti quelli che in qualche modo hanno fatto questo cammino insieme a me.
“I can show you,that when it starts to rain, everything it’s the same, I can show you, I can show you. Rain, I don’t mind. Shine the weather it’s fine. Can you hear me, that when it rains and shines, it’s just a state of mind? Can you hear me? Can you hear me?”