• Non ci sono risultati.

Parte II Parte sperimentale

10.5 Risultati KIRBY BAUER

91

11 Discussioni e conclusioni

I dati raccolti permettono di affermare che la prevalenza di

Salmonella sulle superfici delle carcasse di suino è pari allo 0.96% dei

campioni analizzati (7 campioni positivi su un totale di 730). La prevalenza della positività è bassa e indice di applicazione di prassi di macellazione capaci di evitare la contaminazione delle carcasse lungo la catena di macellazione in stabilimenti di piccole dimensioni. I ceppi di Salmonella sono stati sierotipizzati dal CRN Salmonelle di Padova e analizzati con il metodo PFGE dall’Università di Pisa. L’unico sierotipo identificato è stato Derby e il profilo genotipico è risultato identico. Il fatto che il profilo sia identico fa supporre che gli animali provenissero dallo stesso allevamento di origine oppure che si trattasse di una contaminazione superficiale delle carcasse nel macello. I dati raccolti tramite PFGE sono utilizzati per differenziare cloni di Salmonella, ma in questo studio gli isolati hanno lo stesso profilo PFGE.

Poiché la resistenza agli agenti antimicrobici della Salmonella è un problema mondiale, si è deciso di esaminare nello studio dei ceppi isolati anche la sensibilità ai farmaci. La valutazione della resistenza agli antibiotici dei ceppi di Salmonella isolati dalle spugnette campionate su carcasse suine ha dimostrato la presenza di MDR in tutti i ceppi analizzati, in particolare nei confronti della tigecyclina, dei sulfonamidi e della streptomicina. Nonostante i ceppi abbiano profilo genotipico identico, presentano un diverso profilo di antibioticoresistenza, tuttavia non sempre il fenotipo corrisponde al genotipo ed infatti la PFGE non considera i plasmidi, specie se piccoli, e su questi possono essere presenti geni di resistenza. Non sono state rilevate resistenze alla ampicillina e amoxicillina/ac. clavulanico, alla combinazione sulfametoxazolo/trimetoprim e ai fluorochinoloni. Questo studio conferma il ruolo degli alimenti di origine animale come

92

riserva di ceppi di Salmonella enterica anche multiresistenti e sottolinea la necessità di un continuo monitoraggio di tale patogeno che rappresenta una tra le principali cause di infezioni alimentari. L’antibioticoresistenza è un importante fattore di rischio per la salute umana, a causa dei numerosi fallimenti terapeutici nelle infezioni causate da ceppi resistenti a questi farmaci.

Le metodiche di sierotipizzazione e PFGE potrebbero avvalorare gli studi epidemiologici in caso di tossinfezione e permettere una maggiore collaborazione tra il Servizio Veterinario e il Servizio di Igiene per la gestione delle epidemie. Spesso anche numeri limitati di casi positivi possono fornire utili indicazioni per la gestione dei focolai. Per quanto riguarda il problema dell’antibiotico resistenza sarebbe interessante confrontare il metodo utilizzato Kirby Bauer con il metodo della MIC (studio della concentrazione minima inibente) per valutare le differenze dei risultati e definire la tecnica più idonea per gli studi epidemiologici e/o clinici. Inoltre, a causa della comparsa di resistenza batterica agli antibiotici dovuta anche al loro ampio utilizzo in zootecnia, il controllo delle infezioni da Salmonella negli allevamenti e l’efficace sorveglianza epidemiologica devono essere attuati per individuare i potenziali pericoli e la diffusione dell'infezioni.

Il lavoro svolto in questa tesi rappresenta l’elaborazione dei primi risultati del monitoraggio del Servizio Veterinario per la ricerca di

Salmonella spp. sulle carcasse dei suini macellati in Provincia di

Bolzano, a partire dall’ottobre 2014, secondo il Reg (EU) 218/2014. L’applicazione del nuovo regolamento è stata un’occasione per implementare nel laboratorio dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie la nuova metodologia di screening con il metodo biomolecolare. La PCR- Real Time è sensibile, rapida ed eseguita da

93

personale addestrato e qualificato. Il laboratorio ha riorganizzato gli spazi ed i tempi di analisi e dopo la prima fase di avviamento i risultati sono stati più che soddisfacenti. Il metodo microbiologico è stato utilizzato come screening solo quando i tempi tecnici non permettevano l’esecuzione della PCR Real Time e comunque sempre come metodo di riferimento per la conferma dei campioni positivi. Considerando la Salmonella spp. su carcassa un criterio di igiene di processo e non un criterio di sicurezza, si potrebbe auspicare in futuro l’uso unicamente della PCR Real Time per individuare entro 24 ore le carcasse contaminate da Salmonella e permettere all’operatore del settore alimentare di prestare una maggiore attenzione alla destinazione d’uso della carcassa e alla sua successiva manipolazione.

94

12 Bibliografia

1) SCIENTIFIC REPORT OF EFSA AND ECDC. (2015). The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2013, EFSA Journal, 13(1), 3991.

2) REGOLAMENTO (CE) N. 882/2004 DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 29 aprile 2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali.

3) REGOLAMENTO (CE) n. 2073/2005 DELLA COMMISSIONE del 15 novembre 2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari.

4) SCIENTIFIC REPORT OF EFSA AND ECDC. (2013). The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2011, EFSA Journal, 11(4), 3129.

5) REGOLAMENTO (UE) N. 217/2014 DELLA COMMISSIONE del 7 marzo 2014 che modifica il regolamento (CE) n. 2073/2005 per quanto riguarda la salmonella nelle carcasse di suini.

6) REGOLAMENTO (UE) N. 218/2014 DELLA COMMISSIONE del 7 marzo 2014 che modifica gli allegati dei regolamenti (CE) n. 853/2004 e (CE) n. 854/2004 del Parlamento europeo e del Consiglio e il regolamento (CE) n. 2074/2005 della Commissione.

95

7) REGOLAMENTO (CE) N. 853/2004 DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 29 aprile 2004 che stabilisce norme specifiche in materia di igiene per gli alimenti di origine animale.

8) REGOLAMENTO (CE) N. 854/2004 DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 29 aprile 2004 che stabilisce norme specifiche per l'organizzazione di controlli ufficiali sui prodotti di origine animale destinati al consumo umano.

9) REGOLAMENTO (UE) N. 219/2014 DELLA COMMISSIONE del 7 marzo 2014 che modifica l’allegato I del regolamento (CE) n. 854/2004 del Parlamento europeo e del Consiglio per quanto riguarda i requisiti specifici per l’ispezione post mortem di animali della specie suina domestica.

10) RAPPORTI ISTISAN 05/27-Istituto Superiore di sanità. Infezioni da Salmonella: diagnostica, epidemiologia e sorveglianza.

11) Kauffmann F. (1966). Classificazione e nomenclatura dei sub- genus I e IV delle Salmonelle. Zbl. Ref., 202, 484

12) Le Minor L., Popoff M.Y. (1987). Designation of Salmonella enterica sp. as the type and only species of the genus Salmonella. Int. J. System Bacteriol., 37, 465-468.

13) De Jong H.K., Parry C.M., van der Poll T., Wiersinga W.J. (2012). Host-pathogen interaction in invasive Salmonellosis. Plos Pathog., 8 (10).

96

14) Darwin K.H., Miller V.L. (1999). Molecular basis of the interaction of Salmonella with the intestinal mucosa. Clinic Microbiol. Rev., 12(3), 405-28.

15) Wallis T.S., Galyov E.E. (2000). Molecular basis of Salmonella- induced enteritis. Mol. Microb., 36, 997-1005.

16) Slauch J., Taylor R., Maloy S. (1997). Survival in a cruel world: how Vibrio cholerae and Salmonella respond to an unwilling host. Genes Dev., 11, 1761-74.

17) Baumler A.J., Tsolis R.M., Heffron F. (1997). Fimbrial adhesins of Salmonella Typhimurium. Adv. Exp. Med. Biol., 412, 149-58.

18) Gunn J.S., Ernst R.K., McCoy A.J., Miller S.I. (2000). Constitutive mutation of the Salmonella enterica serovar Typhimurium transcriptional virulence regulator phop. Infect Immun, 68(6), 3758-62

19) Zavanella M. (2001). Tipizzare le salmonelle. Fondazione Iniziative Zooprofilattiche e Zootecniche, Brescia.

20) Lucas R.L., Lostroh C.P., DiRusso C.C., Spector M.P., Wanner B.L., Lee C.A. (2000). Multiple factors independently regulate hilA and invasion gene expression in Salmonella enterica serovar Typhimurium. J. Bacteriol, 182, 1872-1882.

21) Tsolis R.M., Kingsley R.A., Townsend S.M., Ficht T.A., Adams L.G., Baumler A.J. (1999). Of Mice, calves and men. Comparison of the mouse typhoid model with other Salmonella infections. Advances in Experimental Medicine and Biology., 473, 261-274.

97

22) Martin G.D., Chart H., Threlfall E.J. (2000). Invasiveness of Salmonella serotypes Typhimurium and Enteriditis of human gastro-enteric origin for rabbit ileum: role of LPS, plasmids and host factors. J. Med. Microb., 49, 1011-1021.

23) Saylers A., Whitt D.D. (1991). (Ed.). Bacterial pathogenesis: a molecular approach. Washington DC: American Society for Microbiology.

24) Miao E.A., Miller S.I. (2000). A conserved amino acid sequence directing intracellular type III secretion by Salmonella Typhimurium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 13, 7539-7544.

25) Hueck C.J. (1998). Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62(2), 379-433.

26) Lucas R.L., Lee C.A. (2000). Unravelling the mysteries of virulence gene regulation in Salmonella Typhimurium. Mol. Microb., 36, 1024-1033.

27) Ehrbar K., Friebel A., Miller S.I., Hardt W.D. (2003). Role of the Salmonella pathogenicity island 1 (SPI-1) protein invB in type III secretion of SopE and SopE2, two Salmonella effector proteins encoded outside of SPI-1. J. Bacteriol.,185(23), 6950-6967.

28) Eckmann L., Rudolf M.T., Ptasnik A. (1997). D-myo-Inositol 1, 4, 5, 6-tetrakisphosphate produced in human intestinal epithelial cells in response to Salmonella invasion inhibits phosphoinositide 3-kinase signalling patways. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 94, 14456-14460.

98

29) Browne S.H., Lesnick M.L., Guiney D.G. (2002). Genetic requirements for Salmonella induced cytopathology in human monocyte derived macrophages. Infect Immun., 70(12), 7126- 7135.

30) Fierer J., Guiney D. (2001). Diverse virulence traits underlying different clinical outcomes of Salmonella infection. J. Clin. Investig., 107, 775-780.

31) Istituto Nazionale di Statistica (ISTAT). (1997). La mortalità per causa delle regioni italiane, Roma.

32) Tauxe R.V., Pavia A.T. (1998). Salmonellosis: nontyphoidal. In: Evans A.S., Brachman P.S. (Ed.). Bacterial infection of humans: epidemiology and control. New York: third ed. Plenum Medical Book Co, 613-630.

33) Bisbini P., Leoni E., Nanetti A. (2000). An outbreak of Salmonella Hadar associated with roast rabbit in a restaurant. Eur. J. Epidemiol., 16, 613-618.

34) Van Duynhoven Y., Widdowson M.A., Jager T.F. (2002). Salmonella enterica serotype enteritidis phage type 4b outbreak associated with bean sprouts. Emerg. Infect. Dis., 8(4), 440-443.

35) Holt J. (2003). Multistate outbreak of Salmonella Typhimurium infections associated with drinking unpasteurized milk-Illinois, Indiana, Ohio, and Tennessee, 2002-2003. MMWR, 52(26), 613- 615.

99

36) D’Argenio P., Romano A., Autorino F. (1999). An outbreak of

Salmonella Enteritidis infection associated with iced cake.

Eurosurv, 4(2), 24-26.

37) Santos R.L., Zhang S., Tsolis R.M. (2001). Animal model of Salmonella infections: enteritis versus typhoid fever. Microb. Infect, 3, 1335-1344.

38) Wilcock B.P., Schwartz K. (1992). Salmonellosis. In: Leman A.D., Straw B.E. (Ed.). Diseases of Swine. Ames: seventh ed. Iowa State University Press, 570-583.

39) Lemarchand K., Lebaron P. (2002). Influence of mutation frequency on the persistence of Salmonella enterica serotypes in natural waters. FEMS Microbiol. Ecol., 41, 125-131.

40) Melloul A.A., Hassani L., Rafouk L. (2001). Salmonella contamination of vegetables irrigated with untreated wastewater. World J. Microbiol & Biotech, 17, 207-209.

41) Mouwen J. M.V.M., Van Der Gaag I., Pospischil A., Pohelnz J. (2002). Atlante a colori della Patologia Veterinaria dell’Apparato digerente. Giraldi ed.

42) Nowak B., von Müffling T., Chaunchom S., Hartung J. (2007). Salmonella contamination in pigs at slaughter and on the farm: a field study using an antibody ELISA test and a PCR technique”, Inter. Jour. Food Micr., 115, 259-267.

43) Botteldoorn N., Heyndrickx M., Rijpens N., Grijspeerdt K., Herman L. (2003). “Salmonella on pig carcasses: positive pigs

100

and cross contamination in the slaughterhouse”, Jour. Appl. Micr., 95, 891-903.

44) Swanenburg M., Urlings H.A.P., Snijders J.M.A, Keuzenkamp D.A., van Knapen F. (2001). Salmonella in slaughter pigs: prevalence serotypes and critical control points during slaughter in two slaughterhouses. Inter. Jour. Food Micr., 70, 243-254.

45) EFSA (2007). The community summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents, antimicrobial resistance and foodborne outbreaks in the European Union in 2005.

46) Lo Fo Wong D.M.A, Halda T., van der Wolf P.J., Swanenburg M. (2002). Epidemiology and control measures for Salmonella in pigs and pork. Livestock Production Science, 76, 215-222.

47) Scientific Opinion on a Quantitative Microbiological Risk Assessment of Salmonella in slaughter and breeder pigs. EFSA Journal 2010; 8(4):1547 [90 pp.].doi: 10.2903/j.efsa.2010.1547.

48) Quantitative Microbiological Risk Assessment on Salmonella in Slaughter and Breeder pigs: Final Report EFSA-Q-2008-05013.

49) REGOLAMENTO (UE) 2015/1474 DELLA COMMISSIONE del 27 agosto 2015 relativo all'utilizzo di acqua calda riciclata per eliminare la contaminazione microbiologica superficiale dalle carcasse.

50) Chau P.Y., Shortridge K.F. and Huang C.T. (1977). Salmonella in pig carcasses for human consumption in Hong Kong; a study on the mode of contamination. J. Hyg., 78(2), 253-260.

101

51) Gill, C.O. and Bryant, J. (1992). The contamination of pork with spoilage bacteria during commercial dressing, chilling and cutting of pig carcasses. Int. J. Food Microbiol., 16, 51-62.

52) Gill C.O. and Bryant J. (1993). The presence of Escherichia coli, Salmonella and Campylobacter in pigs carcass dehairing equipment. Food Microbiology, 10, 337-344.

53) Mølbak K., Olse J.E. and Wegener H.C. (2006). Salmonella infections. In: Foodborne infections and intoxications. Third edition. Eds.Rieman, H.P and D.O. Cliver. School of Veterinary Medicine, University of California, Davis. Academic press, Elsevier.

54) Hald T., Wingstrand A., Swanenburg M., von Altrock A. and Thorberg B.M. (2003). The occurrence and epidemiology of Salmonella in European pig slaughterhouses. Epidemiol. Infect., 131(3), 1187-1203.

55) Rabsch W., Tschap, H., Baumler A.J. (2001). Non-typhoidal salmonellosis: emerging problems. Microbes Infect. 3, 237-247.

56) Graziani C., Galetta P., Busani L., Dionisi A.M., Filetic, E., Ricci A., Caprioli A., Luzzi I. (2005). Le infezioni da Salmonella: diagnostica, epidemiologia e sorveglianza. Rapporti ISTISAN. 05/27, 49.

57) Barnaud G., Arlet G., Verdet C., Gaillot O., Lagrange P.H., Philippon A. (1998). Salmonella enteritidis: AmpC plasmid- mediated inducible betalactamase (DHA-1) with an ampR gene

102

from Morganella morganii. Antimicrob Agents Chemother. 42, 2352-2358.

58) http://www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013/pdf/ar- threats-2013-508.

59) Enter-Vet Report 2013. A cura di Centro di referenza nazionale per le salmonellosi Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, disponibile online nel sito www.izsvenezie.it

60) REGULATION (EC) No. 2160/2003 OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 17 November 2003 on the control of salmonella and other specified food-borne zoonotic agents.

61) Nota del Servizio Veterinario Aziendale prot. 0095336-BZ del 18/08/2014.

62) REGOLAMENTO (CE) N. 1441/2007 DELLA COMMISSIONE del 5 dicembre 2007 che modifica il regolamento (CE) n. 2073/2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari.

63) DIRETTIVA 2003/99/CE DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 17 novembre 2003 sulle misure di sorveglianza delle zoonosi e degli agenti zoonotici, recante modifica della decisione 90/424/CEE del Consiglio e che abroga la direttiva 92/117/CEE del Consiglio.

64) Müller L. (1923). Un nouveau milieu d’enrichissement pour la recherche du bacille typhique et des paratyphiques. Compt. rend. Soc. biol., 89, 434-437.

103

65) Taylor W.I. (1965). Isolation of shigellae. I. Xylose lysine agars; new media for isolation of enteric pathogens. Am. J. Clin. Pathol., 44, 471-475.

66) Kauffmann F. (1935). Weitere Erfahrungen mit dem Kombinierten Anreicherungsverfahren für Salmonellen bacillen. Z. Hyg. Infekt. Krkh., 117, 26-32.

67) POPOFF M.Y., LE MINOR L. (1997). Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 7th revision. WHO collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris, France.

68) Ribot E.M., Fair M.A., Gautom R., Cameron D.N., Hunter S.B., Swaminathan B., Barrett T.J. (2006). Standardization of pulsed- field gel electrophoresis protocols for the subtyping of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella for PulseNet. Foodborne Pathog. Dis. Spring, 3(1), 59-67.

69) PulseNet (2009). One-Day (24-28 h) Standardized Laboratory Protocol for Molecular Subtyping of Escherichia coli O157:H7, Salmonella serotypes, Shigella sonnei, and Shigella flexneri by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Sections 5.1, 5.2, 5.4 of the PulseNet PFGE Manual.

70) Tenover F.C., Arbeit R.D., et al., 1995. Interpreting chromosoma DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J. Clin. Microbiol., 33, 2233-2239.

104

71) CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute. (2012). Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard—Eleventh Edition. CLSI document M02-A11. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute.

72) Casillas E., Kenny M.A., Minshew B.H., Schoenknecht F. (1981). Effect of ionized calcium and soluble magnesium on the predictability of the performance of Mueller-Hinton agar susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa with Gentamicin. Antimicrob. Agents Chemother., 19, 987-992.

73) EUCAST, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 2.0, valid from 2012-01-01.

74) Lynne A.M., Kaldhone P., David D., White D.G., Foley S.L. (2009). Characterization of Antimicrobial Resistance in

Salmonella enterica Serotype Heidelberg Isolated from Food

Animals, Foodborne Pathogens and Disease, 6 (2).

75) Rayamajhi N., Kang S.G., Kang M.l., Lee H.S., Park K.Y., Yoo H.S. (2008). Assessment of Antibiotic Resistance Phenotype and Integrons in Salmonella enteric serovar Typhimurium Isolated from Swine. J. Vet. Med. Sci., 70(10), 1133–1137.

76) Brown S.D., Traczewski M.M. (2007). Comparative in vitro antimicrobial activity of tigecycline, a new glycylcycline compound, in freshly prepared medium and quality control. J. Clin. Microbiol. 45(7), 2173-2179.