Risultati fase 1
I campioni di cute affetti da trombiculosi (Trombicula autumnalis), come risultato dalla prova con diafanizzazione mediante KOH test, erano rispettivamente 16/60 per la provincia di Lecco e 25/131 per la Val D’Ossola.
All’osservazione al microscopio, previa colorazione con ematossilina-eosina, evidenziavano infiltrato cellulare infiammatorio, e , due di questi ( 3249* e 24054*) mostravano la presenza fisica del parassita.
I camosci non infestati da trombiculosi (tabella 5) alla colorazione con ematossilina- eosina non presentavano infiltrato infiammatorio.
I 4 campioni di cute che presentavano altra ectoparassitosi, riferibile ad infestazione da zecche Ixodidae , 3/4 erano risultati positivi al KOH test. In questi campioni, all’ ematossilina-eosina è stato possibile valutare la presenza di infiltrati infiammatori da perivascolari ad interstiziali, da minimi a moderati, multifocali, caratterizzati dalla presenza di qualche granulocita eosinofilo e linfocita.
Le larve di Trombicula autumnalis (Figura 13 e 14) erano localizzate sulla superficie cutanea al di sopra dello strato cheratinico, entrambi gli acari avevano il corpo orientato perpendicolarmente alla superficie della cute e esso allo strato corneo con i cheliceri dell’ apparato buccale, lo gnatosoma (figura 15). Al di sotto dei parassiti si osservava lo stilosoma come una struttura a forma di cono rovesciato costituito da una parte centrale rosata, eosinofila, ed i margini caratterizzati da aree di necrosi di colore blu. Lo stilosoma si sviluppa nella parte intraepidermica ed occupa anche la porzione superficiale del derma con la sua estremità. Anche in assenza del rilievo dei parassiti, in alcuni dei casi positivi all’KOH si è riscontrata la presenza dello stilosoma (11/41).
Le reazioni flogistiche comprendono ipercheratosi e paracheratosi dello strato corneo e presenza di un numero elevato di macrofagi, granulociti neutrofili ed eosinofili caratteristici di una risposta cellulo mediata.
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Si osservano iperplasia epidermica con ipercheratosi, croste sierocellulari e presenza di un parassita adeso alla superficie cutanea, con asse maggiore in
direzione perpendicolare all’epidermide. Nel contesto dell’ epidermide e del derma superficiale si osserva una struttura compatta, amorfa, eosinofilica riferibile ad uno stilosoma. Nel derma sono evidenti infiltrati infiammatori diffusi con lieve fibrosi (figura 13).
Figura 13 – Larva di Trombicula autumnalis con stilosoma, 10x, E-E.
Sezione di cute. Si evidenziano l’apparato buccale, gnatosoma (Gn) della larva (LT), attraverso cui si ancora allo strato corneo (Sc) dell’epidermide (Ep). Si valuta il cono eosinofilico (CE) determinato dalla saliva che il parassita
produce e attraverso la quale inizia la formazione dello stilosoma (St). Ai lati del cono si possono valutare la presenza di necrosi (N) e infiltrato infiammatorio (InIf).
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Figura 14, maggiore ingrandimento della foto precedente. Si nota che il parassita presenta una cuticola esterna eosinofilica chitinosa che riveste una cavità
contenente sezioni di apparato digerente, un apparato boccale rivolto verso la superficie epidermica e sei paia di zampe (larva di Trombicula autumnalis). Lo stilosoma sottostante risulta circondato da detriti cellulari basofili e cellule infiammatorie .
Figura 14 - Larva di Trombicula autumnalis, 20X, E-E.
(LT) larva di T. autumnalis, (Gn) gnatosoma, (CE) cono eosinofilico, (St) stilosoma, (N) necrosi, (Sc) strato corneo, (Ep) epidermide.
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Dall’ immagine (figura 15) si denotano i tre segmenti di natura chitinosa, che articolandosi tra loro vanno a formare il chelicero.
Inoltre, si osserva come i cheliceri di T. autuminalis perforino lo strato epidermico, andando a costituire il cono eosinofilico dello stilosoma.
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Nel derma si nota la presenza di una sezione circolare di stilosoma, amorfo, debolmente PAS-positivo, circondato da diffusa reazione infiammatoria composta prevalentemente da macrofagi, linfociti, granulociti neutrofili ed eosinofili e rare plasmacellule. L’ epidermide sovrastante è moderatamente iperplasico. Come descritto in letteratura (Shatrov, 2000,2009), la porzione più esterna dello stilosoma è costituita da un complesso di glicoproteine, che con la colorazione PAS si presenta debolmente PAS positivo (Figura 16).
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Come evidente in Figura 17, i campioni analizzati e positivi al test del potassio idrato mostrano segni di lieve iperplasia dell’epidermide e moderata ipercheratosi con dermatite caratterizzata dalla presenza di diffusi infiltrati infiammatori costituiti da macrofagi, linfociti, granulociti eosinofili associati alla presenza di sezione circolare di stilosoma eosinofilico. Lo stilosoma risulta circondato da detriti cellulari.
Figura 17- Infiltrato infiammatorio e stilosoma di Trombicula autumnalis, 20X, E-E.
In figura 17 si evidenziano lo stilosoma (St) della larva e l’infiltrato infiammatorio (InIf) da essa determinato, lo strato corneo (Sc) e l’epidermide (Ep).
St Sc Ep
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Risultati fase 2
Per meglio studiare le popolazioni cellulari presenti a livello dell’infiltrato infiammatorio è stata effettuata la colorazione immunoistochimica rispettivamente per le sottopolazioni linfocitarie B (Ab anti-CD79α+) e T (Ab anti-CD3+) e per i macrofagi (Ab anti-CD68+).
I risultati di questa fase si possono osservare nelle foto (Figure 18, 19, 20, 21) in cui si riscontra una presenza di macrofagi (Figura 18, 19) intorno allo stilosoma, linfociti B (Figura 20) e T (Figura 21), con netta prevalenza della popolazione macrofagica su quella linfocitaria.
Gli infiltrati macrofagici (CD68+) che circondano lo stilosoma vanno a formare una reazione a carattere granulomatoso attorno allo stilosoma, ma hanno anche una localizzazione diffusa nel derma circostante.
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Forte ingrandimento della figura 18. Si osserva la positività citoplasmatica granulare dei macrofagi con anticorpo anti-CD68, caratterizzati da citoplasma abbondante e propaggini citoplasmatiche.
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L’anticorpo CD79α+ ha messo in evidenza la presenza di linfociti B e plasmacellule multifocali negli infiltrati infiammatori del derma (figura 20).
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Mediante CD3 vengono osservati rari linfociti T (CD3+) nell’ infiltrato infiammatorio non direttamente a contatto con lo stilosoma, ma nelle sue adiacenze (figura 21).
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Conclusioni
In questo elaborato di tesi abbiamo riscontrato la presenza dell’ infiltrato infiammatorio e dello stilosoma determinato dalla larva del parassita in 11/41 dei soggetti positivi al KOH test; di questi, 2/41 presentavano, oltre alle lesioni sopracitate, anche la larva di T. autumnalis. Grazie a tali risultati, l’ indagine ha consentito di studiare anche l’interazione parassita-ospite.
L’ incidenza dell’ ectoparassitosi è stata del 27% nei soggetti provenienti dalla provincia di Lecco e del 19% per quelli della Val D’Ossola, senza differenze significative tra loro (p>0.05). Inoltre i soggetti affetti da trombiculosi formavano dei cluster rappresentati dai distretti di Campelli-Maesimo, Resegone (Lecco) e Vigezzo (Val D’Ossola).
L’ 85% dei camosci positivi al test KOH e affetti da trombiculosi si localizzava a quote comprese tra i 1400 e i 1800 metri di altitudine (35/41), questo, probabilmente legato all’attività biologica del parassita che risente della temperatura ambientale. Infatti Trombicula autumnalis è attivo soprattutto a temperature comprese tra i 19 e i 25 °C e inattivo sotto i 15°C (www.lucianoschiazza.it). Per quanto riguarda i 6 casi riscontrati a quote diverse da queste, 4/41 sono stati identificati ad altitudini inferiori di 1400 metri e 2/41 a quote superiori di 1800 metri. È possibile pensare che il parassita si stia adattando ad un range di temperatura ambientale più ampio, oppure, come spiegazione più semplicistica, che i camosci affetti da trombiculosi si siano spostati in altri distretti, a quote diverse da quelle sopracitate.
Si osserva, inoltre, come i camosci maggiormente affetti da Trombiculosi siano soggetti di età compresa tra 1 e 4 anni.
A causa della localizzazione delle larve è stato difficile rilevare la presenza di parassiti all’esame istopatologico, probabilmente rimossi durante la processazione. Il numero di T.autumnalis riscontrato mediante raschiato cutaneo, test di elezione per il rilievio di parassiti a localizzazione superficiale, è risultato infatti di gran lunga superiore rispetto a quanto riscontrato all’esame istopatologico (solo 2).
Tramite istopatologia è stata pero’ riscontrata la presenza di un altro parassita riferibile a zecche Ixodidae in 4 dei 191 campioni esaminati, 3 dei quali positivi al test
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del potassio idrato. Poiché il lavoro di ricerca intrapreso era volto allo studio della trombiculosi, ed essendo la presenza di zecche un reperto comune negli animali che vivono in ambiente selvatico, queste non erano state segnalate al momento dell’invio dei campioni.
Tramite istopatologia abbiamo potuto identificare la presenza del parassita (2 casi) compatibile con acaro T.autumnalis per dimensioni e per morfologia anche se l’identificazione certa del parassita era già stata eseguita tramite test KHO. Con l’esame istopatologico è stato pero’ possibile identificare oltre che al parassita anche l’interazione di questo acaro con l’ospite espletata attraverso la formazione del suo stilosoma. Infatti, contemporaneamente all’azione meccanica dei cheliceri sulla cute, la larva produce saliva, che contenedo enzimi digestivi, determina la lisi dei cheratinociti. Lo stilosoma, al di sotto delle larve, si osserva come una struttura conica e tubulare costituita da una parte centrale rosata, eosinofila, ed i margini caratterizzati da aree di necrosi di colore blu. Lo stilosoma si sviluppa nella parte intraepidermica ed occupa anche la porzione superficiale del derma con la sua estremità.
Le lesioni istopatologiche rilevate alla colorazione con ematossilina eosina sono risultate caratteristiche di una dermatite cronica con segni di lieve ipercheratosi e paracheratosi ed infiltrazione flogistica superficiale, media e profonda del derma. La caratterizzazione dell’infiltrato flogistico, mediante l’immunoistochimica, ha consentito di evidenziare come questo risultasse essere costituito da una presenza elevata di macrofagi, granulociti eosinofili, linfociti B, rispetto ai linfociti T che risultano essere poco rappresentati.
La massiva presenza di macrofagi è determinata dalla reazione “da corpo estraneo” nei confronti dello stilosoma della larva che perfora l’epidermide, mentre i granulociti eosinofili ed i linfociti B sono caratteristici di una risposta immuno-mediata dell’ ospite, di tipo Th2, responsabile dei fenomeni allergici segnalati nelle diverse specie animali e nell’ uomo in corso di trombiculosi.
In conclusione il nostro studio ha confermato la presenza di Trombiculosi nelle popolazioni di camoscio presenti nel nostro arco alpino, come segnalato in precedenza in Sϋdtirol e in Austria (Shatrov Andrew B., 2009); l’esame
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istopatologico è utile non tanto nel riconoscimento del parassita, che avviene mediante altre tecniche elettive, ma per il rilievo di parti del parassita che effettivamente interagiscono con l’ospite, ovvero lo stilosoma. Tramite l’esame istopatologico e l’immunoistochimica è stata anche caratterizzata per la prima volta l’infiltrazione flogistica in corso di trombiculosi nel camoscio Alpino (Rupicapra rupicapra subsp. Rupicapra)
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Ringraziamenti
Tutte le persone citate in queste pagine hanno svolto un ruolo fondamentale nella stesura del mio elaborato di tesi, ma desidero precisare che ogni errore o imprecisione è imputabile soltanto a me.
Vorrei ringraziare innanzitutto il Professor Alessandro Poli per avermi dato la possibilità di lavorare con lui al mio progetto di tesi, per i preziosi consigli ed insegnamenti al riguardo e per essere stato sempre disponibile, paziente e comprensivo con me. A lui va tutta la mia stima.
Ringrazio la Dottoressa Claudia Salvadori che ha sempre avuto mille premure per la sottoscritta, aiutandomi non poco alla realizzazione della tesi.
I miei ringraziamenti vanno alla Prof. Francesca Abramo, per l’estrema professionalità e disponibilità dimostratami.
Voglio ringraziare il tecnico di laboratorio biomedico Davide Lorenzi che, oltre ad insegnarmi “l’arte del taglio al microtomo” ed aiutarmi nelle varie fasi di preparazione dei miei campioni, ha reso il periodo trascorso in laboratorio piacevole e divertente. Col cuore, ma davvero con tanto cuore, ringrazio i miei due angeli (mica tanto) custodi, due veterinari, due professionisti, due amici speciali : il Dottor Guido Rocchigiani con cui ho trascorso momenti davvero memorabili nel corso della mia vita da universitaria ( e le foto lo dimostrano!) e che si è sempre reso disponibile per togliermi qualsiasi dubbio durante la stesura della mia tesi; la Dottoressa Camilla Lazzarotti, conosciuta da poco (purtroppo), che si è fin da subito dimostrata disponibile a supportarmi e sopportarmi per qualsiasi cosa ed in ogni situazione, posso dire di aver trovato un’ Amica. Ragazzi non so ancora come e quanto ringraziarvi per l’aiuto impagabile che mi avete dato!
Ringrazio sentitamente il Dottor Andrea Bertani, che da qualche mese mi ha dato la preziosa opportunità di frequentare il suo ambulatorio veterinario per imparare questo meraviglioso mestiere.
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Un grazie speciale va ad Aurora ed Irene, le mie amiche storiche targate “Unipi” , con voi non sono mai mancate le risate, i consigli, gli abbracci, le chiacchere, le feste della birra (e i bagni delle feste della birra), le braciate, gli scoop, i cocker, il Mugello, Vale46 ed ancora tante risate. Vi voglio un mondo di bene amiche mie!
Ringrazio Nicola, amico e collega, per aver sempre potuto contare su di lui e con il quale ho affrontato allenamenti sulle piagge, necroscopie di tassi, immunoistochimiche, feste anni ’90 e quant’altro durante questi anni.
Vorrei ringraziare Valentina, anche se adesso ci siamo un allontanate, che ha fatto parte della mia quotidianità, della mia casa, del mio mondo quasi come una sorella. Alle bimbe conosciute in laboratorio, Giulia e Carolina, voglio dire un miliardo di grazie per essermi state cosi vicine durante tutto il periodo trascorso insieme.
Un ringraziamento doveroso va ai ragazzi del mio corso Adriana, Alice, Alessandra, Cristina, Elena, Fiammetta, Flavia, Valentina C, Martina, Federica, Giulia, Marta, Lolla, Julietta, Silvia, Ado, il Della e Mirko che per me ci sono sempre stati.
Voglio ringraziare anche gli altri ragazzi che ho conosciuto durante questo mio cammino e che non ho nominato finora: Chiara, Viola, Martina, Eleonora, Nadia, Simo, Andre, Dome, il Donny e tutto il resto della ciurma.
Il ciclismo, uno sport, uno stile di vita, una filosofia. A lui sono infinitamente grata per avermi insegnato che con tanti sacrifici, determinazione, fatica, forza di volontà e credendo sempre in ciò che si fa si riescono a raggiungere traguardi impensabili. Basta crederci sempre e non arrendersi mai.
Desidero ringraziare i miei suoceri, Luciana e Flavio, perché mi hanno sempre aiutato in qualsiasi modo, contribuendo non poco al raggiungimento di questo mio traguardo.