Gli RTKs, una volta attivati, dopo un certo tempo vengono internalizzati e trasferiti in compartimenti intracellulari; l'endocitosi ligando-indotta è stata considerata per lungo tempo un meccanismo destinato esclusivamente alla degradazione del recettore e quindi alla terminazione della segnalazione.
Recenti studi hanno dimostrato come i recettori all'interno degli endosomi rimangono attivi e quindi che l'endocitosi potrebbe avere un ruolo fondamentale nella regolazione della segnalazione cellulare.
La funzione più evidente dell'endocitosi è quella di rimuovere i complessi ligando- recettore dalla membrana,per permettere alla cellula di ricevere ulteriori segnali, ma l'internalizzazione degli RTK è un processo molto complesso e strettamente regolato, che ha più di un ruolo nella segnalazione. L'endocitosi potrebbe avere due funzioni nella regolazione del segnale: controllare l'intensità e la specificità della risposta. Inizialmente l'endocitosi è stata scoperta per il recettore dell'EGF, il quale, in seguito ad interazione con il ligando, va incontro a rapida internalizzazione, con un meccanismo che richiede l’attività cinasica intrinseca del recettore e specifici motivi nel dominio C-terminale di questo. Il recettore complessato con il ligando viene reclutato all’interno di fossette rivestite da clatrina (CCPs, clathrin-coated pits) che poi si staccano dalla membrana cellulare formando vescicole rivestite da clatrina (CCVs, clathrin-coated vescicles). Le molecole di clatrina si auto-assemblano, formando una rete che crea un’invaginazione della membrana da cui si formano le CCP, interviene poi la GTPasi dinamina per promuovere il distacco delle vescicole dalla membrana. La dinamina è una proteina ad alto peso molecolare (100 KDA) con attività GTPasica, che gioca un ruolo chiave nella formazione delle vescicole rivestite da clatrina (Damke H et al., 1994; Hinshaw JE et al., 1995).
Si conoscono tre isoforme della dinamina: la dinamina 1 espressa nel cervello, la dinamina 2 ubiquitaria e la dinamina 3 presente nei testicoli (Liu J et al., 1995).Tutte e tre le isoforme hanno un dominio N-terminale GTPasico coinvolto nel legame e nell'idrolisi del GTP. Il dominio GTPasico è caratterizzato da un'elevata attività GTPasica basale e da una bassa affinità per il GTP; la regione centrale ha un dominio PH (pleckstrin homology) che lega specificamente il fosfatidilinositolo-4,5- bisfosfato; la regione C-terminale comprende una struttura elica-elicata (coiled-coil)
Introduzione I. Il recettore del PDGF
chiamata GED (GTPasi effector domain) che è coinvolta nella polimerizzazione e nell'auto-assemblaggio della dinamina; il GED è seguito dal dominio PRD (proline-
rich domain) che interagisce con il dominio SH3 (Src homology 3), presente in molte
proteine.
Secondo il modello più accreditato, l'attività GTPasica della dinamina è legata a cambiamenti conformazionali indotti dalla guanosina, che portano all'auto- assemblaggio della dinamina (Muhlberg AB et al., 1997; Kessels MM et al., 2001). La dinamina è associata alle fossette rivestite presenti nella membrana plasmatica nella forma legante il GDP, lo scambio GDP/GTP porta all'auto-assemblaggio della dinamina intorno al collo dell'invaginazione, formando un collare. La dinamina assemblata idrolizza il GTP e subisce i cambiamenti conformazionali necessari per la formazione delle vescicole. La dinamina legante GDP si disassembla e viene quindi riciclata (fig.12).
Figura 12. formazione delle vescicole rivestite da clatrina nel processo di endocitosi
Le proteine più abbondanti presenti nelle vescicole rivestite sono la clatrina e le proteine adattatrici come AP2, che si legano direttamente alla clatrina per dare inizio al processo di formazione delle vescicole, ma si legano anche al recettore e reclutano una serie di proteine regolatrici per l'endocitosi, portandole dal citoplasma in prossimità recettore. A questo punto il recettore entra nel cosiddetto compartimento degli endosomi “precoci” e questo passaggio sembra essere mediato da motivi Leu- Leu della regione iuxtamembrana del recettore.
Dopo l'internalizzazione negli endosomi precoci, i recettori possono andare incontro ad un processo di ricircolo ed essere riciclati sulla membrana, oppure sono indirizzati
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agli endosomi multivescicolari per la degradazione (Marmor M et al., 2004; Katzmann DJ et al., 2002). Gli endosomi precoci e tardivi hanno diversa localizzazione subcellulare, infatti i precoci sono distribuiti più perifericamente, mentre i tardivi si trovano nella zona perinucleare; ci sono anche altre caratteristiche che li distinguono, gli endosomi tardivi appaiono spesso come corpi multivescicolari (MVBs, multivescicular bodies) con una membrana esterna che racchiude le vescicole interne, inoltre rispetto agli endosomi precoci i tardivi sono arricchiti di proteine specifiche e di acido liso-bifosfatidico. I recettori passano dalla membrana esterna alle vescicole interne degli MBV quando entrano nella via di degradazione (fig.13).
Figura 13. Processo di endocitosi, dalle vescicole rivestite di clatrina, alla formazione degli endosomi precoci e tardivi
L'internalizzazione degli RTKs è mediata da Cbl, una proteina che si lega al recettore attivato, promuove la multiubiquitinazione (de Melker AA et al., 2001) e quindi il passaggio negli MVB (Haglund K et al., 2003). Anche il recettore del PDGF e quello del CSF-1 sono controllati negativamente da Cbl; nel caso del recettore di CSF-1,
Introduzione I. Il recettore del PDGF
Cbl si associa al recettore direttamente sulla superficie cellulare, accelerando il processo di internalizzazione.
Gli EGF-R internalizzati hanno tutte le stesse caratteristiche dei recettori attivati sulla membrana: sono legati all’EGF, sono in forma dimerica, sono fosforilati in tirosina e interagiscono con proteine adattatrici contenenti domini SH2 e PTB, che collegano il recettore alle molecole effettrici. Ad esempio le proteine adattatrici Shc e Grb2 sono strettamente associate al recettore attivo sia quando si trova sulla superficie cellulare sia durante l’endocitosi portando all'attivazione di tutti i componenti della cascata delle MAPK (Di Guglielmo GM et al., 1994; Haugh J M et al., 1999; Kranenburg O et al., 1999).
Quindi la segnalazione dell’EGF non termina con l’internalizzazione, ma i recettori internalizzati continuano a segnalare finché non entrano nel compartimento degli endosomi tardivi, quando il recettore viene allontanato dalle sue molecole effettrici e il segnale è spento. Questo meccanismo potrebbe rappresentare un meccanismo per avere diverse modalità di regolazione spaziale e temporale della trasduzione del segnale, ma alcuni studi ipotizzano che dagli endosomi l’EGF-R possa attivare vie di segnalazione specifiche, diverse da quelle attivate dal recettore stesso in superficie (Vieira AV et al., 1996).
A lungo si è pensato che l'endocitosi clatrina dipendente o CME (clathrin mediated
endocytosis) fosse la via principale coinvolta nell'internalizzazione dei recettori di
membrana, come appunto l'EGF-R (Kirchhauesn T, 2002), ma successivi studi hanno dimostrato che molti recettori vengono endocitati attraverso una via clatrina indipendente. L'esistenza di questa via è stata dibattuta per lungo tempo e sono attualmente in corso studi per delucidare il meccanismo molecolare alla base di questo processo.
L'internalizzazione indipendente da clatrina è sensibile alla deplezione di colesterolo, questo dato ha portato all'idea che in questa via siano coinvolte particolari strutture della membrana chiamate lipid-raft ed è stata chiamata per questo RME (lipid-raft
mediated endocytosis). Tale ipotesi è stata ulteriormente confermata dal fatto che
molti componenti legati ai lipid-raft sembrano essere endocitati tramite vie non clatrino-mediate. Contrariamente all'endocitosi clatrino-mediata, non si conosce molto del meccanismo che regola la biogenesi delle vescicole in queste vie non
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classiche. Comunque sembra che la caveolina, una proteina residente nei lipid-raft, abbia un ruolo importante almeno in alcune di queste vie.
L'endocitosi indipendente da clatrina può portare le molecole verso vari compartimenti intracellulari, inclusi l'apparato del Golgi e il reticolo endoplasmatico (Pelkmans L et al.,2001; Nichols BJ, 2001) e anche a compartimenti endocitotici.
Alcuni recettori sono internalizzati mediante CME, altri mediante RME, ma alcuni possono presentare entrambi i processi, e il significato di questo potrebbe essere che i due processi servano per scopi diversi. Ad esempio, il recettore del TGF-β viene internalizzato tramite CME per il suo normale processo di ricircolo, nel quale continua a segnalare, mentre la frazione di recettori internalizzati mediante RME è quella destinata alla degradazione (Di Guglielmo GM et al., 2003).
Studi sull'EGF-R sostengono che quando il recettore è stimolato con basse concentrazioni di ligando viene internalizzato esclusivamente attraverso un meccanismo clatrina-dipendente, mentre a concentrazioni elevate entra in gioco anche una via clatrina-indipendente, definita in base alla sua sensibilità verso Filipina e Nistatina (sostanze che interferiscono con la formazione dei rafts). Sembra che le due vie CME e RME siano associate rispettivamente con la segnalazione e la degradazione del recettore (Sigismund S et al., 2005).
Introduzione. L’ipossia e HIF