5. DISCUSSIONE
5.1 Ruolo di N4BP1 nella regolazione di Itch e dei suoi substrati
La HECT ligasi Itch è stata oggetto di studio del nostro laboratorio in quanto responsabile dell’ubiquitinazione e della successiva degradazione proteosoma- dipendente di p73. I miei studi sono stati indirizzati verso l’analisi della modalità d’azione della proteina N4BP1, interattore di Itch, e delle conseguenze funzionali prodotte sui substrati della ligasi.
Numerosi meccanismi di regolazione dell’attività di Itch sono stati ampiamente caratterizzati e comprendono sia modificazioni post-traduzionali che interazioni con differenti proteine regolatrici. Brevemente, l’attivazione catalitica di Itch risulta essere dipendente dall’azione della chinasi1 Jun N-terminale (JNK). JNK è infatti responsabile della fosforilazione di Itch nei residui Ser/Thr. In seguito alla fosforilazione la ligasi subisce un cambiamento conformazionale tale da permettere un’apertura della struttura
86 ed una conseguente interazione con i suoi substrati (Gao et al., 2004; Gallagher et al., 2006). Un’altra chinasi coinvolta nella regolazione dell’attività di Itch è Src Fyn. Fyn fosforilando Itch nel residuo Tyr373 impedisce l’interazione tra la ligasi e i suoi substrati regolando negativamente l’attività catalitica di Itch (Yang et al., 2006).
Recentemente sono stati identificati degli interattori di Itch: Ndfip1 e Numb. Ndfip1 interagisce con Itch in seguito a stimolazione delle cellule T e potenzia l’attività catalitica di Itch (Hettema et al., 2004; Oliver et al., 2006). Analogamente, Numb è responsabile di una regolazione positiva nei confronti dell’attività di ubiquitinazione di Itch, determinando un incremento della degradazione proteasoma-dipendente di Notch (McGill et al., 2003).
Ad oggi non era però stata identificata alcuna proteina interattore di Itch con funzione inibitoria. Nel nostro laboratorio è stata dimostrata l’interazione tra la proteina a funzione ignota N4BP1 (interattore della ligasi Nedd4) ed Itch.
Lo studio del ruolo di N4BP1 nella regolazione di Itch e la caratterizzazione del meccanismo molecolare che ne è alla base, costituiscono l’argomento della prima parte del mio lavoro di dottorato.
Attraverso differenti approcci biologici quali il silenziamento in cellule umane o l’utilizzo di knock down genetico in modelli murini, abbiamo osservato che l’assenza di N4BP1 induce una riduzione dei livelli proteici dei vari substrati di Itch, quali p73, c-Jun e JunB dovuta ad una loro maggiore degradazione proteosoma-dipendente.
In particolare la stabilità di c-Jun è stata monitorata in cellule MEF N4BP1 WT vs KO. L’induzione del substrato di Itch, in seguito a trattamento con radiazioni ultraviolette è notevolmente ridotta in cellule MEF N4BP1 KO rispetto alle cellule N4BP1 WT. Parallelmente ad una riduzione dei livelli proteici di c-jun e di p73 abbiamo osservato che in cellule MEF N4BP1 KO l’attività trascrizionale di entrambi i fattori risulta notevolmente ridotta se paragonata all’attività in cellule N4BP1 WT. Abbiamo inoltre dimostrato che l’overespressione di N4BP1, in maniera reciproca alla sua delezione, induce un aumento sia dell’emivita che dell’attività trascrizionale di entrambi c-Jun e p73. Presi tutti insieme, questi dati dimostrano che N4BP1 svolge un’attività inibitoria nei confronti di Itch modulando l’ubiquitinazione e la degradazione proteosoma-dipendente dei suoi diversi substrati.
Abbiamo poi indagato nel dettaglio il meccanismo attraverso il quale N4BP1 esercita la sua azione nei confronti di Itch.
87 Tramite saggi di legami in vitro, abbiamo dimostrato che N4BP1 e p73 legano lo stesso dominio WW2 di Itch suggerendo quindi un meccanismo di competizione tra le due proteine per il legame alla ligasi. In particolare tramite un saggio di competizione in
vitro, abbiamo dimostrato che N4BP1 compete con p73 per il legame ad Itch.
È noto dalla letteratura che i livelli di Itch diminuiscono in seguito a danno genotossico, condizione in cui p73 si accumula e viene indotto trascrizionalmente per svolgere le sue funzioni pro-apoptotiche (Rossi et al., 2005). Parallelamente alla diminuzione dei livelli di Itch, l’attivazione di N4BP1 potrebbe costituire un ulteriore meccanismo “di difesa” esercitato dalle cellule in risposta al danno al DNA. Al fine di comprendere più dettagliatamente la funzione svolta da N4BP1 sarà interessante studiare se questa proteina possa essere modulata in condizioni di stress cellulare o di danno al DNA, ovvero in tutti quei processi biologici in cui p73 risulta essere più attivo. Per esempio, meccanismi di inibizione dell’attività di ubiquitinazione di Itch su p73 potrebbero determinare un rapido aumento dei livelli proteici di p73. Nel contesto descritto potrebbe essere plausibile l’ipotesi di un aumento dei livelli proteici di N4BP1 in seguito a danno o a stress cellulare in maniera da inibire la funzionalità della ligasi Itch e conseguentemente permettere un aumento della stabilità dei suoi vari substrati tra cui p73. p73 potrebbe in queste condizioni esercitare la sua funzione trascrizionale e transattivare i diversi geni bersaglio coinvolti nell’arresto del ciclo cellulare e nell’induzione apoptotica.
Lo studio presentato in questa prima parte della tesi, identifica in N4BP1 un nuovo regolatore dell’attività catalitica di Itch. Inoltre tale studio suggerisce un nuovo meccanismo che potrebbe regolare la stabilità di p73 in seguito a danno al DNA e conseguentemente modulare la risposta apoptotica dopo trattamento chemioterapico (Figura 38).
Figura 38: Modello del meccanismo d’azione di N4BP1. N4BP1 compete con i substrati di Itch
per lo stesso sito di legame (dominio WW2) posto sulla ligasi. L’interazione tra N4BP1 e la ligasi determina un accumulo dei substrati con conseguente aumento della loro attività trascrizionale.
88 Nel loro complesso, i risultati mostrati portano alla conclusione che N4BP1 eserciti una funzione di controllo secondario ed indiretto sui diversi substrati di Itch. Questa evidenza risulta molto interessante nell’ottica di un ipotetico impiego di molecole analoghe a N4BP1 come agenti in grado di contrastare l’attività catalitica di Itch con successivo aumento della stabilità dei suoi substrati.